擬柱胞藻的營(yíng)養(yǎng)成分與培養(yǎng)

擬柱胞藻的營(yíng)養(yǎng)成分與培養(yǎng)查廣才;楊東娟;鄒海鷹【摘要】通過(guò)純化濃縮，收集低鹽度養(yǎng)蝦池水體中的擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii),分析擬柱胞藻營(yíng)養(yǎng)成分與元素組成，結(jié)果顯示：藻體含碳42.67%、氫6.87%、氮8.80%,C/N比為4.85,粗蛋白含量為54.97%,粗脂肪含量為4.26%.藻體富含23種微量和稀有元素，其中重金屬Cr、Cu、Pb、Ni和Ti的含量較高，表明擬柱胞藻具有強(qiáng)的富集環(huán)境重金屬和耐污能力.通過(guò)改良稀釋Zarrouk培養(yǎng)基，在溫度為30(±1)°C、光照強(qiáng)度為20klx、100r/min的振蕩器中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10d,細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)104個(gè)/mL,培養(yǎng)過(guò)群中藻絲形態(tài)會(huì)發(fā)生變化.【期刊名稱(chēng)】《廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)》【年(卷)，期】2010(037)008【總頁(yè)數(shù)】3頁(yè)(P6-8)【關(guān)鍵詞】擬柱胞藻;營(yíng)養(yǎng)組成;純化培養(yǎng)【作者】查廣才;楊東娟;鄒海鷹【作者單位】韓山師范學(xué)院生物系廣東，潮州,521041;韓山師范學(xué)院生物系廣東，潮州,521041;韓山師范學(xué)院生物系廣東，潮州,521041【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】Q949.22+5擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii),又稱(chēng)拉氏擬柱胞藻，為藍(lán)藻類(lèi)原核生物，屬念珠藻目念珠藻科柱胞藻屬［1］。在不同的環(huán)境和生長(zhǎng)條件下，同一種類(lèi)的形態(tài)變化較大，因此，在我國(guó)擬柱胞藻有中華尖頭藻和拉氏擬魚(yú)腥藻等多個(gè)名稱(chēng)［2-3］。擬柱胞藻在高水溫、富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊和水庫(kù)中生長(zhǎng)良好，頻繁形成藻華［4-5］，是發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生毒素的最新藍(lán)藻種類(lèi)，其產(chǎn)生的擬柱胞藻毒素是一種細(xì)胞毒素，能導(dǎo)致肝臟和腎臟損害［6-8］，對(duì)DNA和RNA都有損傷，但并不是所有種類(lèi)都產(chǎn)生毒素。由于擬柱胞藻具有較強(qiáng)的入侵性，加之全球氣候變暖，其種群分布不斷由熱帶、亞熱帶向溫帶地區(qū)擴(kuò)散［9-10］，我國(guó)的廣東、山東、浙江、云南、湖北及臺(tái)灣均有發(fā)現(xiàn)，且全球很多地區(qū)淡水飲水源地都發(fā)現(xiàn)有毒擬柱胞藻［11-12］，引起各國(guó)科學(xué)工作者的關(guān)注與研究，而擬柱胞藻在國(guó)內(nèi)的研究尚屬空白，對(duì)其元素組成及人工培養(yǎng)國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究的擬柱胞藻取自珠海、中山等廣東珠三角地區(qū)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)低鹽度養(yǎng)殖蝦池，該藻在低鹽度、高水溫、富營(yíng)養(yǎng)化的蝦池環(huán)境中可形成高而穩(wěn)定的種群數(shù)量，但對(duì)對(duì)蝦的養(yǎng)殖表現(xiàn)為有益而不是有害［13］。為確定擬柱胞藻的生物學(xué)特性，本研究對(duì)擬柱胞藻的營(yíng)養(yǎng)成分及元素組成進(jìn)行了定量和定性分析，并實(shí)現(xiàn)該藻在實(shí)驗(yàn)室條件下的人工純化培養(yǎng)，可為我國(guó)的環(huán)境保護(hù)、水產(chǎn)養(yǎng)殖及擬柱胞藻開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料擬柱胞藻分析測(cè)試樣品，于2005年4月取自廣東中山市橫欄鎮(zhèn)凡納濱對(duì)蝦低鹽度養(yǎng)殖蝦池，水樣取回實(shí)驗(yàn)室靜置過(guò)夜，利用擬柱胞藻在靜置水體中漂浮并聚集于水面形成水華的特性，收集漂浮聚集在水面上的高純度擬柱胞藻，再通過(guò)8000r/min離心分離收集樣品，凍干保存。1.2試驗(yàn)方法1.2.1擬柱胞藻碳、氫、氮含量測(cè)定稱(chēng)取1.962mg擬柱胞藻凍干樣品，采用德國(guó)ElementarVarioEL元素分析儀測(cè)定C、H、N的含量。1.2.2粗脂肪含量測(cè)定稱(chēng)取0.2g擬柱胞藻凍干樣品，加入10mL正己烷萃取，取正己烷萃取液，蒸干溶劑，稱(chēng)重。1.2.3擬柱胞藻元素組成分析稱(chēng)取0.4g擬柱胞藻凍干樣品，加高濃度的HNO3、HC1O4消化，溶液加熱溫度高于100°C，用水稀釋定容后發(fā)現(xiàn)有少量不溶物，過(guò)濾后取清液，根據(jù)JY/T015-1996(國(guó)家教委“感耦等離子體原子發(fā)射光譜方法通則”)，用全譜直讀等離子體原子發(fā)射光譜儀IRISAdvantage(HR)(美國(guó)ThermoJarrellAshCorporation)對(duì)其元素含量進(jìn)行定性分析。1.2.4擬柱胞藻的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基配制。擬柱胞藻培養(yǎng)基的配制，首先配制Zarrouk培養(yǎng)基原液［14］和微量元素混合液(BaC12?H2O0.07g,Pb(NO3)20.099g,Na3AsO40.018g,Sr(NO3)20.063g,La(NO3)3?6H2O0.04g,SnC14?5H2O0.025g,蒸餾水定容至1L)，取微量元素混合液1mL,加入Zarrouk培養(yǎng)基原液，用蒸餾水定容至1L完成改良Zarrouk培養(yǎng)基的配制，將改良Zarrouk培養(yǎng)基稀釋10倍，用150mL三角錐形瓶分裝20mL,高溫滅菌后即可用于擬柱胞藻的培養(yǎng)。(2)分離純化。通過(guò)反復(fù)對(duì)比試驗(yàn)，得到擬柱胞藻的有效分離純化方法：取少量樣品用培養(yǎng)基稀釋?zhuān)詈笥妹?xì)管在顯微鏡下挑取單個(gè)目標(biāo)藻，并在載玻片上漂洗3~4次，洗去其他雜藻，最后挑取單個(gè)擬柱胞藻進(jìn)行接種培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)方法。擬柱胞藻實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度控制在30(±1)C,光照強(qiáng)度20kLx，光源為白熾燈，連續(xù)不間斷光照；將接種后的培養(yǎng)瓶置于恒溫振蕩器中震蕩培養(yǎng)(100r/min)。(4)擬柱胞藻的生長(zhǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的擬柱胞藻純培養(yǎng)液1mL(2.0x104個(gè)/mL)接種到新鮮培養(yǎng)液(每瓶20mL)中培養(yǎng)，每批接種5瓶，共培養(yǎng)3批。每天定時(shí)取樣,每個(gè)培養(yǎng)瓶重復(fù)計(jì)數(shù)3次，用20cmx20mm浮游生物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)，每次取0.1mL培養(yǎng)液置于計(jì)數(shù)框，每個(gè)計(jì)數(shù)框在10x40倍顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)視野，還原為每毫升藻絲數(shù)量，連續(xù)觀察計(jì)數(shù)3個(gè)生長(zhǎng)周期。2結(jié)果與分析2.1擬柱胞藻營(yíng)養(yǎng)成分通過(guò)ElementarVarioEL和IRISAdvantage(HR)元素分析儀檢測(cè)分析，擬柱胞藻。、H、N3種主要元素的含量為：C42.67%,H6.87%,N8.80%,C/N為4.85，根據(jù)N含量推測(cè)粗蛋白質(zhì)含量為54.97%(N含量x6.25),粗脂肪含量的測(cè)定結(jié)果為4.26%，說(shuō)明擬柱胞藻為一種高蛋白藻類(lèi)，其粗蛋白和脂肪的含量接近人工培養(yǎng)的鈍頂螺旋藻［14］。2.2擬柱胞藻元素組成表1為擬柱胞藻除C、H、N3種主要元素以外不同含量范圍的元素組成，常量元素共8種，其中Al元素在其他藍(lán)藻體內(nèi)的含量并不高，在擬柱胞藻體內(nèi)檢測(cè)出較高含量，可能是該藻對(duì)環(huán)境中大量AI2+的富集作用所致，因?yàn)樵跀M柱胞藻的培養(yǎng)基中并不需要AI元素。在擬柱胞藻體內(nèi)微量和稀有元素多達(dá)23種，其中Ba、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sr、Ti、Zn等9種微量元素上升為次常量元素，含量顯著偏高，藻體內(nèi)還富含As、Ce、Co、La、Li、Mo、Nd、Sc、Sn、V、Y、Zr等12種微量元素。由擬柱胞藻的元素組成可知，該藻的生長(zhǎng)需要大量微量元素和稀有元素，同時(shí)對(duì)一些常見(jiàn)有害元素Cr、Cu、Pb、As等具有明顯的富集作用和較強(qiáng)的耐受能力。表1擬柱胞藻元素組成含量范圍1x103-1x105pg/g30-1x103pg/g1~30pg/g元素Al、Ca、Fe、K、Mg、Na、P、SBa、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sr、Ti、ZnAs、B、Ce、Co、La、Li、Mo、Nd、Sc、Si、Sn、V、Y、Zr2.3擬柱胞藻純化培養(yǎng)擬柱胞藻目前較為有效的分離純化方法是用毛細(xì)管在顯微鏡下挑取單個(gè)目標(biāo)藻，并通過(guò)逐級(jí)稀釋和轉(zhuǎn)移，最后接種單個(gè)目標(biāo)藻到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。擬柱胞藻的培養(yǎng)需要較低的鹽度和豐富的微量元素，培養(yǎng)基是經(jīng)過(guò)改良的Zarrouk培養(yǎng)基。Zarrouk培養(yǎng)基用于螺旋藻培養(yǎng)，鹽度高，擬柱胞藻適宜的生長(zhǎng)鹽度在0.5%。~2%。，必須經(jīng)過(guò)稀釋才能培養(yǎng)，但直接稀釋的Zarrouk培養(yǎng)基也培養(yǎng)不出擬柱胞藻，通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果與Zarrouk培養(yǎng)基成分對(duì)比分析，擬柱胞藻比螺旋藻需要更多種微量元素，根據(jù)擬柱胞藻體內(nèi)元素組成，篩選組合出不同于Zarrouk培養(yǎng)基的微量元素混合液，加入Zarrouk培養(yǎng)基中，稀釋10倍滅菌，可用于擬柱胞藻的培養(yǎng)，效果良好。擬柱胞藻生長(zhǎng)需要較高的溫度、光強(qiáng)，同時(shí)需要不斷地?cái)噭?dòng)。擬柱胞藻的適宜生長(zhǎng)溫度為30^左右，光照強(qiáng)度在20kLx，連續(xù)與間斷光照均可，與鈍頂螺旋藻培養(yǎng)條件類(lèi)似；擬柱胞藻的培養(yǎng)需要不斷攪動(dòng)或震蕩，靜置狀態(tài)還培養(yǎng)不出擬柱胞藻，攪動(dòng)的主要作用是促進(jìn)藻殖體的斷裂增殖。實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的擬柱胞藻，擬柱胞藻的藻絲形態(tài)變化較大，有線(xiàn)型和螺旋卷曲兩種主要形態(tài)，在廣東珠江三角洲地區(qū)的低鹽度蝦池中以螺旋卷曲型為主，因此，本試驗(yàn)的擬柱胞藻為螺旋卷曲型，但在培養(yǎng)過(guò)程中，有部分螺旋卷曲型轉(zhuǎn)變?yōu)榫€(xiàn)型藻絲。2.4擬柱胞藻生長(zhǎng)規(guī)律擬柱胞藻在適宜的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)周期為10d，從接種時(shí)藻體數(shù)量1.0x103cells/mL到最大密度(3.3x104cells/mL)只需要1周時(shí)間，第8d藻體數(shù)量開(kāi)始減少，第9d大部分藻體已解體，培養(yǎng)藻液由藍(lán)綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，藻絲也由緊密規(guī)則的螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷刹灰?guī)則螺旋，呈現(xiàn)明顯的老化。擬柱胞藻在適宜條件下種群增長(zhǎng)快，有一個(gè)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)過(guò)程，但當(dāng)種群數(shù)量達(dá)到最大后，個(gè)體死亡分解呈直線(xiàn)下降，種群的崩潰和消亡發(fā)生在很短的時(shí)間內(nèi)。擬柱胞藻的個(gè)體增長(zhǎng)與蝦池中所觀察到的種群增長(zhǎng)規(guī)律一致，從蝦池中發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻到形成高優(yōu)勢(shì)度的優(yōu)勢(shì)種，一般也只需要1周左右的時(shí)間，種群增長(zhǎng)快，不同的是在蝦池中擬柱胞藻一旦形成優(yōu)勢(shì)種，其種群比較穩(wěn)定［13］。3結(jié)論與討論擬柱胞藻近幾年爆發(fā)于廣東珠三角地區(qū)低鹽度養(yǎng)殖對(duì)蝦中后期富營(yíng)養(yǎng)化水體中。通過(guò)對(duì)蝦池中擬柱胞藻的樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻的蛋白質(zhì)和脂肪等主要營(yíng)養(yǎng)成分與人工大量生產(chǎn)的鈍頂螺旋藻比較接近，但微量和稀有元素的種類(lèi)多，重金屬含量高；因?yàn)閿M柱胞藻的個(gè)體小、生物量少以及人工培養(yǎng)擬柱胞藻的規(guī)模小，目前還沒(méi)有人工培養(yǎng)擬柱胞藻營(yíng)養(yǎng)成分的分析結(jié)果，人工培養(yǎng)的擬柱胞藻和蝦池中的擬柱胞藻在營(yíng)養(yǎng)成分及元素組成上存在何種差別，有還待進(jìn)一步研究。在鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)基中加7種不同的微量元素，降低鹽度即可實(shí)現(xiàn)擬柱胞藻的培養(yǎng)，盡管擬柱胞藻的培養(yǎng)需要大量的微量和稀有元素，但取自低鹽度蝦池的擬柱胞藻體的元素組成與培養(yǎng)基中的元素組成存在很大的差別，蝦池環(huán)境中擬柱胞藻體的重金屬種類(lèi)和含量顯著高于培養(yǎng)基，稀有元素的種類(lèi)也明顯曾多，說(shuō)明擬柱胞藻對(duì)蝦池中的重金屬和微量元素具有明顯的富集作用和較強(qiáng)的耐受力。因此，擬柱胞藻的元素組成與其生長(zhǎng)環(huán)境有密切關(guān)系，擬柱胞藻可替代鈍頂螺旋藻或其他藻類(lèi)生物用于廢水處理和重金屬回收系統(tǒng)［14］。此外，大量的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，凡是以擬柱胞藻為優(yōu)勢(shì)種的蝦池，對(duì)蝦均生長(zhǎng)健康良好，對(duì)低鹽度對(duì)蝦健康養(yǎng)殖有重要作用，相反，以有毒微囊藻為優(yōu)勢(shì)種的低鹽度蝦池，對(duì)蝦均發(fā)病死亡［13］，表明廣東珠三角地區(qū)蝦池中的擬柱胞藻沒(méi)有產(chǎn)生藍(lán)藻毒素，不同于其他環(huán)境中的種類(lèi)［15］，但對(duì)其他陸生哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生毒害，還有待進(jìn)一步觀察。擬柱胞藻作為高蛋白低藻類(lèi)，能否用于大規(guī)模生產(chǎn)，人工培養(yǎng)的擬柱胞藻營(yíng)養(yǎng)組成是否對(duì)人和動(dòng)物有益，也值得進(jìn)一步研究。擬柱胞藻的純化培養(yǎng)是在高溫、強(qiáng)光、不斷震蕩的條件下完成。已有的研究表明，含有大量重金屬和豐富微量元素的低鹽度蝦池，養(yǎng)殖水溫在25~30°C，渦輪機(jī)械增氧，養(yǎng)殖中后期水體富營(yíng)養(yǎng)化，這種低鹽度蝦池水體環(huán)境適宜擬柱胞藻的生長(zhǎng)，部分蝦池出現(xiàn)擬柱胞藻形成的水華，但在水體鹽度超過(guò)6%。，沒(méi)有機(jī)械攪動(dòng)增氧或沒(méi)有發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化的蝦池，很少發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻，因此，高水溫、低鹽度、機(jī)械攪動(dòng)和富營(yíng)養(yǎng)化是擬柱胞藻爆發(fā)的重要條件[13]；與蝦池中的擬柱胞藻相比，人工培養(yǎng)的擬柱胞藻藻絲明顯延長(zhǎng)，螺旋數(shù)增多，且藻體中的大量氣泡消失。目前，在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下尚未發(fā)現(xiàn)藻絲產(chǎn)生異形胞，在晚秋的蝦池水體中發(fā)現(xiàn)部分藻絲兩端具異形胞，但實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和蝦池水體中均未發(fā)現(xiàn)有厚壁孢子的產(chǎn)生[16]。參考文獻(xiàn)：RebekahMK.ScientificName:Cylindrospermopsisraciborskii(Woloszyhska,1912),SeenayyaandSubbaRaju,1972[EB/OL]./res/Programs/ncrais/docs/factsheets/cylindrospermopsis_raciborskii.pdf,2007.項(xiàng)斯端，周麗蘋(píng).拉氏擬魚(yú)腥藻的個(gè)體發(fā)育及其分類(lèi)問(wèn)題[J].植物分類(lèi)學(xué)報(bào),1990,28(5):341-344.ShafikHM,VorosL,SproberP,etal.SomespecialmorphologicalfeaturesofCylindrospermopsinraciborskiiinbatchandcontinuouscultures[J].Hydrobiologia,2003,506-509:163-167.SakerML,GriffithsDJ.OccurrenceofbloomsofthecyanobacteriumCylindrospermopsisraciborskii(Woloszynska)SeenayyaandSubbaRajuinanorthQueenslanddomesticwatersupply[J].MarineandFreshwaterResearch,2001,52(6):907-915.RyanEF,HamiltonDP,BarnesG.RecentoccurrenceofCylindrospermopsisraciborskiiinWaikatolakesofNewZealand[J].NewZealandJournalofMarineandFreshwaterResearch,2003,37:829-836.HongY,SteinmanA,BiddandaB,etal.Occurrenceofthetoxin-producingcyanobacteriumCylindrospermopsisraciborskiiinMonaandMuskegonLakes,Michigan[J].JournalofGreatLakesResearch,2006,32:645-652.BernardC,HarveyM,BriandJF,etal.ToxicologicalcomparisonofdiverseCylindrospermopsisraciborskiistrains:evidenceofliverdamagecausedbyFrenchC.raciborskiistrain[J].EnvironmentalToxicology,2003,18(3):176-186.SakerML,ThomasAD,NortonJH.CattlemortalityattributedtothetoxiccyanobacteriumCylindrospermopsisraciborskiiinanoutbackregionofNorthQueensland[J].EnvironmentalToxicology,1999,14(1):179-182.BriandJF,LeboulangerC,HumbertJF,etal.Cylindrospermopsisraciborskii(Cyanobacteria)invasionatmidlatitudes:selection,widephysiologicaltolerance,orglobalwarming[J].JournalofPhycology,2004,40(2):231-238.VidalL,KrukC.Cylindrospermopsisraciborskii(Cyanobacteria)extendsitsdistributiontoLatitude34°53’S:taxonomicalandecologicalfeaturesinUruguayaneutrophiclakes[J].Pan-AmericanJournalofAquaticSciences,2008,3(2):142-151.WilliamWJ,SarahS.DistributionandAbundanceofCylindrospermopsisraci