核酸的提取制藥

生物制藥工藝課程核酸的提取制藥一、基本概念

核酸類藥物包括核酸及其降解產(chǎn)物和衍生物。分兩大類：具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)：多數(shù)生物體能自身合成。

這類藥物能夠改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝平衡，加速修復(fù)受損組織，促使機(jī)體恢復(fù)正常生理功能。2.自然結(jié)構(gòu)為堿基、核苷、核苷酸類似物或聚合物：通過(guò)自然結(jié)構(gòu)的核酸類藥物半合成生產(chǎn)。

這類藥物是當(dāng)今治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制劑的臨床藥物。5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤核酸類藥物5-氟尿嘧啶藥理作用（作用機(jī)制）核酸類藥物

核酸分為兩大類：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）RNA與DNA的差異

DNA

RNA糖脫氧核糖核糖堿基AGCTAGCU

不含稀有堿基含稀有堿基98％核中（染色體中）真核線粒體mitochondrialDNA（mDNA）核外葉綠體chloroplastDNA（chDNA）DNA擬核原核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒

RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占90%。核酸的組成1.元素組成：CHONP核酸核苷酸核苷磷酸戊糖堿基嘌呤嘧啶核酸的基本化學(xué)組成其中，P元素含量較恒定，為9.1%，即為1g磷酸相當(dāng)于11g核酸。2.核苷酸組成：核苷酸的基本結(jié)構(gòu)OO（N=A、G、C、T、U）HH(O)H1′2′NOHCH2HH5′4′3′PO-OOO-核糖磷酸堿基DNA的提取與純化RNA的提取與純化核酸類藥物

一、核酸的兩性解離性質(zhì)

二、核酸的溶解性三、核酸的紫外吸收（λmax=260nm）

四、核酸的鑒定核酸類藥物線性大分子（粘度高,抗剪切力差）可用電泳或離子交換（色譜）進(jìn)行分離。核酸類藥物

核酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了核酸的性質(zhì)。一、核酸的兩性解離性質(zhì)酸性基團(tuán)---磷酸基---中強(qiáng)酸堿性基團(tuán)---氨基，堿基---弱堿DNApI=4~4.5RNApI=2~2.5總結(jié)：（1）兩性電解質(zhì)（2）等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)核酸類藥物二、核酸的溶解性DNA和RNA微溶于水.室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA在堿性條件下水解。0.14摩爾法-----DNA蛋白與RNA蛋白的分離方法大多數(shù)核酸(RNA與DNA)與蛋白結(jié)合組成核蛋白形式存在.兩種核酸蛋白在水中的溶解度受鹽濃度的影響不相同.DNA蛋白1～2mol/LNacl溶解度大是在水中的2倍0.14mol/LNacl溶解度最小RNA蛋白0.14mol/LNacl溶解度大在實(shí)驗(yàn)室中，有用濃鹽法制備DNA或RNA，為什么？核酸類藥物DNA的紫外吸收光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長(zhǎng)（nm）光吸收123三、核酸的紫外吸收核酸類藥物四、核酸的鑒定加熱條件下，D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色(RNA)D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色(DNA)核酸類藥物一、RNA的提取與制備

工業(yè)用RNA的提?。?）RNA及其工業(yè)來(lái)源：從微生物中提取RNA是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法。一些最常見(jiàn)的菌體含有豐富的核酸資源，如酵母、白地霉、多種抗菌素的菌絲體——青霉素的產(chǎn)黃青霉菌體。通常在細(xì)菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。

在菌體內(nèi)RNA含量的變化受培養(yǎng)基組成影響，其中關(guān)鍵是銨離子濃度和磷酸鹽濃度。培養(yǎng)酵母菌體收率高，易于提取RNA。很顯然在許多酵母中，早期細(xì)胞中的RNA含量高，其確切數(shù)值取決于碳、氮比例和培養(yǎng)基組成等。（2）高RNA含量酵母菌株的篩選

可以從自然界篩選到RNA含量高的酵母菌株，也可用誘變育種的方法提高酵母菌的RNA含量。

稀堿法：是用氫氧化鈉溶液（1%），使細(xì)胞壁變性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。需用酸中和PH7。然后除去菌體，將pH調(diào)至RNA的等電點(diǎn)（pH2.5），使RNA沉淀出來(lái)。上法的缺點(diǎn)是制得的RNA分子量較低,(磷酸單脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90℃保持3－4h破壞酶)。

濃鹽法：是用高濃度鹽溶液（6%－8%）處理，同時(shí)加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。要避免分子降解，可采用苯酚法制備RNA。用苯酚處理生物材料，使蛋白質(zhì)變性，然后離心，上層水溶液內(nèi)含有全部RNA，可用乙醇沉淀出來(lái)。脫氧核糖核蛋白溶于濃鹽溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L鹽溶液。（3）RNA的提取實(shí)例：

啤酒酵母是提取RNA的很好的資源。取100g壓榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH3g的水，20℃以下緩慢攪拌30分鐘。用6mol／LHCl調(diào)至pH7，攪拌15分鐘，離心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／LHCl調(diào)pH2.5，置冷過(guò)夜，離心得RNAl.8g（純度80％）。RNA提取實(shí)例：

[提取][中和]HCl[酸化、沉淀]HCl酵母提取液上清液RNA

NaOH、水pH7、離心pH2.5、離心二、DNA的提取與制備

工業(yè)用DNA的提取

取新鮮冷凍魚(yú)精20kg，用絞肉機(jī)粉碎2次成漿狀，加入等體積水，攪拌均勻，傾入反應(yīng)鍋內(nèi)，緩慢攪拌，升溫至100℃，保溫15分鐘，迅速冷卻至20～25℃，離心除去魚(yú)精蛋白等沉淀物，獲得35L含熱變性DNA的溶液，經(jīng)精確測(cè)定DNA含量后直接可用于酶法降解生產(chǎn)脫氧核苷酸。如要制成固體狀DNA，在熱變性DNA溶液中逐漸加入等體積95％乙醇，離心可獲得纖維狀DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗滌，減壓低溫干燥得DNA粗品，產(chǎn)品含熱變性DNA50％～60％。工業(yè)用DNA的提取

[提取][熱變性][沉淀]乙醇魚(yú)精提取液上清液纖維狀DNA

水、100℃

15min

冷卻、離心70%--80%

（無(wú)生物活性）

[干燥]

粗品DNA（熱變性后無(wú)活性）

具有生物活性DNA的制備動(dòng)物內(nèi)臟（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理鹽水經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎1分鐘，勻漿于2500r／pm離心30分鐘，沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗后離心，將沉淀懸浮于20倍重量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶劑）十二烷基磺酸鈉，并攪拌2～3小時(shí)，在0℃2500r／pm離心，在上層液中加入等體積的冷95％乙醇，離心即可得到纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于適量蒸餾水，加入5％十二烷基磺酸鈉達(dá)1／10體積，攪拌1小時(shí)，經(jīng)5000r／pm離心1小時(shí)，清液中加入NaCl達(dá)1mol／L，再緩慢加入冷95%乙醇，DNA析出，經(jīng)乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制備需在0～3℃操作）。

[提取]

[洗滌3次]5%SDS

動(dòng)物內(nèi)臟沉淀沉淀上層液離心、30min（肝、脾）生理鹽水生理鹽水[再搗碎]

[沉淀][洗滌、干燥][提取]

纖維狀DNA

粗品DNA

上清液

離心95%乙醇冷乙醇、丙酮水、5%SDS

[沉淀]

[洗滌、干燥]