2023學(xué)年完整公開課版LCMS基礎(chǔ)知識(shí)

LC-MS基礎(chǔ)知識(shí)色譜－質(zhì)譜聯(lián)用成套儀器MultiDeansSwitching多維氣相/氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀

質(zhì)量范圍：m/z1.5-1090三重四極桿LC-MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀LC-MS：液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀

■

LC:Liquidchromatography,HPLC;

■MS:Massspectrometry;

■LC-MS,LC-MS/MS■Applications:內(nèi)容HPLC:Highperformanceliquidchromatography一、高效液相色譜儀ThermoFisher公司watersAgilent1260InfinityAgilent1260InfinityAgilent1260InfinityAgilent1260Infinity色譜的發(fā)明俄國科學(xué)家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻(xiàn)固定相：碳酸鈣流動(dòng)相：石油醚過程：淋洗色斑（帶）依次排列：色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器……廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……在技術(shù)，理論及應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段超高效：1、什么是高效液相色譜2、流程及主要部件

（processandmainassemblyofHPLC）HPLC的儀器配置色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑高壓輸液泵應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。維護(hù)保養(yǎng)：防堵塞，如鹽分、固體顆粒等要注意。流動(dòng)相過濾、每次用了含鹽分的洗脫液要用水沖洗。

外梯度（高壓梯度）:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度（低壓梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。梯度淋洗裝置進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：維護(hù)保養(yǎng)：用有機(jī)溶劑和水交替沖洗管路和進(jìn)樣口等，保持干凈。高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

柱子保存？不能干，密封，有機(jī)溶劑?？梢苑旁诘蜏?，但不能冷凍。完成分析后按要求沖洗珠子。HPLC檢測器a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。ㄈ莘e8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。紫外燈有壽命的，在沖洗柱子的時(shí)候可以不開燈就不要開。光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。b.光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器c.示差折光檢測器

（differentialrefractiveindexdetector）

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。d.熒光檢測器

（fluorescencedetector）

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。防污染，樣品濃度不能高，洗脫液純度要求高。E蒸發(fā)光散射檢測器-通用檢測器定期按照說明書對(duì)霧化室清潔，蒸發(fā)室和檢測室由工程師清潔。3.色譜相關(guān)術(shù)語

色譜圖：HPLC圖形結(jié)果（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間?！V峰保留時(shí)間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值保留時(shí)間峰面積分離度分離度的公式：R：分離程度的量度對(duì)稱因子計(jì)算示意圖

色譜峰的對(duì)稱性—對(duì)稱因子：

a.

拖尾因子

b.

不對(duì)稱因子式中：

fs=0.95~1.05為正常峰

fs＜0.95為前延峰

fs＞1.05為拖尾峰始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。塔板理論

①在色譜柱內(nèi)每一“塔板”H內(nèi)，組分在兩相間瞬間達(dá)到分配平衡。②流動(dòng)相間歇式進(jìn)入色譜柱，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。③分配系數(shù)在各塔板內(nèi)是常數(shù)。④縱向擴(kuò)散可以忽略。塔板理論假定：理論塔板數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差（峰寬或半峰寬）和保留時(shí)間的關(guān)系：H=L/n

踏板理論的優(yōu)缺點(diǎn)提出了理論踏板數(shù)定量描述柱效；影響柱效的因素不明確；如何提高柱效？流動(dòng)相流速對(duì)柱效的影響？1956年，荷蘭學(xué)者范第姆特(VanDeemter)提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。速率理論塔板高度渦流擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻抗項(xiàng)H=A

+B/u+CuA：不受u影響B(tài)/u：u↑,H↓Cu：（

Cm、Cs

）

u↑,H↑

速率理論

流動(dòng)相線速度對(duì)塔板高度的影響

ACuH=A

+B/u+Cu4色譜新技術(shù)整體柱傳統(tǒng)：高壓實(shí)現(xiàn)高效（細(xì)顆粒固定相）。整體柱：低壓高效。未來的HPLC-nanoHPLC柱子：整體柱，200um5cm流速：2.5uL/min檢測池：3nL檢測器：MS進(jìn)樣濃度：500fmol柱子：整體柱，200um1000mm流速：0.7pL/min檢測池：3nL檢測器：MS（300-2000m/z)進(jìn)樣體積：1uL平行色譜nanoHPLC未來的HPLC-multidimensionalHPLC質(zhì)譜：按照離子的質(zhì)量對(duì)電荷比值(即質(zhì)荷比)的大小依次排列所構(gòu)成的圖譜，稱為質(zhì)譜。質(zhì)譜分析：利用質(zhì)譜進(jìn)行定性、定量分析和結(jié)構(gòu)分析的方法稱為質(zhì)譜分析法。質(zhì)譜分析的特點(diǎn)：

①.質(zhì)譜法是唯一可以確定物質(zhì)分子質(zhì)量的方法，且可以確定化合物的化學(xué)式和進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。②靈敏度極高，鑒定最小量達(dá)10-10g，檢出限可達(dá)10-14g。（fg=10-15g)二、質(zhì)譜分析法質(zhì)譜分析檢測的是離子的質(zhì)量質(zhì)譜中采用的質(zhì)量單位–Da=Dalton(道爾頓)質(zhì)量單位,等于一個(gè)碳原子(12C)質(zhì)量的十二分之一，約為1.66×10-24克;一克約為6×1023道爾頓–amu=atomicmassunit,原子質(zhì)量單位1amu=1Da■名義質(zhì)量數(shù)(標(biāo)稱質(zhì)量）

–采用元素質(zhì)量數(shù)的整數(shù)進(jìn)行計(jì)算,例如:C=12,H=1,O=16■單同位素質(zhì)量數(shù)或準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)

–用豐度最大的同位素準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)計(jì)算

–例如：12C=12，1H=1.0078，16O=15.9948■平均質(zhì)量數(shù)或化學(xué)質(zhì)量數(shù)

–考慮到所有天然同位素豐度的該元素原子量來計(jì)算

–例如：C=12.001，H=1.00794，O=15.9994■質(zhì)譜獲得的單電荷離子的m/z值，是單同位素質(zhì)量數(shù)質(zhì)量數(shù)的計(jì)算天然同位素豐度1、質(zhì)譜儀與質(zhì)譜分析原理

massspectrometerandmassspectrometry進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場致電離4.激光

1.單聚焦2.雙聚焦3.飛行時(shí)間4.四極桿

質(zhì)譜儀需要在高真空下工作：離子源（10-310-5Pa

）質(zhì)量分析器（10-6Pa

）(1)大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲；(2)用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起放電；(3)引起額外的離子－分子反應(yīng)，改變裂解模型，譜圖復(fù)雜化。

離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。質(zhì)譜儀的離子源種類很多，現(xiàn)將主要的離子源介紹如下。2、離子源電子電離源(ElectronIonization，EI)■電子轟擊電離又稱為電子轟擊，或電子電離。■轟擊電壓50-70eV,有機(jī)分子的電離電位一般為7-15eV?？商峁┴S富的結(jié)構(gòu)信息?！鰧?duì)于易電離的物質(zhì)降低電子能量，而對(duì)于難電離的物質(zhì)則加大電子能量（常用70eV）?！鲇行╇x子的分子離子不出現(xiàn)或者很偌。

離子室內(nèi)的反應(yīng)氣（甲烷等；10~100Pa，樣品的103~105倍），電子（100~240eV）轟擊，產(chǎn)生離子，再與試樣分離碰撞，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子?；瘜W(xué)電離源（ChemicalIonization，CI）:特點(diǎn)：

i）最強(qiáng)峰為準(zhǔn)分子離子；

ii）譜圖簡單；

Iii）不適用難揮發(fā)試樣；++氣體分子試樣分子+準(zhǔn)分子離子電子(M+1)+;(M+17)+;(M+29)+;化學(xué)電離源是一種軟電離方式在電子轟擊下，甲烷首先被電離:CH4+eCH4++CH3++CH2++CH++C++H2++H++ne-甲烷離子與分子進(jìn)行反應(yīng)，生成加合離子：CH4++CH4CH5++CH3CH3++CH4C2H5++H2加合離子與樣品分子反應(yīng)：CH5++XHXH2++CH4C2H5++XHX++C2H6場致電離源（FI）電壓：7-10kV；d<1mm；強(qiáng)電場將分子中拉出一個(gè)電子；特點(diǎn)：

分子離子峰強(qiáng)；碎片離子峰少；不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定；陽極+++++++++++++陰極d<1mm場解吸FD電離：樣品不需汽化,預(yù)先附在處理好的場離子發(fā)射體上,送入離子源,然后通以微弱電流,使樣品分子從發(fā)射體上解吸下來,并擴(kuò)散至高場強(qiáng)的場發(fā)射區(qū),進(jìn)行離子化。適用于難汽化,熱不穩(wěn)定的樣品.如:糖類，肽類，金屬有機(jī)化合物，聚合物等。SolidsolutionMatrix/analyte/cations基質(zhì)輔助激光解析電離

Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization

(MALDI)MALDI適用于生物大分子得到分子離子峰，碎片少特別適合于飛行時(shí)間質(zhì)譜計(jì)。流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；氣簾的作用：霧化；蒸發(fā)溶劑；阻止中性溶劑分子電噴霧電離（ESI）RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets試樣離子準(zhǔn)分子離子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他離子電噴霧電離（ESI）瑞利極限

電噴霧電離電噴霧產(chǎn)生多電荷離子，相對(duì)分子質(zhì)量Mr計(jì)算：選相鄰峰，電荷n，n+1m1=(Mr+n)/2m2=(Mr+n+1)/(n+1)計(jì)算結(jié)果如表。不適用于非極性化合物NanoESIsource(left)andnanoESIemitter(right)

它的結(jié)構(gòu)與電噴霧源大致相同，不同之處在于APCI噴咀的下游放置一個(gè)針狀放電電極，通過放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+和O+

等離子，溶劑分子也會(huì)被電離，這些離子與分析物分子進(jìn)行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化，這些反應(yīng)過程包括由質(zhì)子轉(zhuǎn)移和電荷交換產(chǎn)生正離子，質(zhì)子脫離和電子捕獲產(chǎn)生負(fù)離子等。大氣壓化學(xué)電離APCI大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離分析中等極性的化合物主要產(chǎn)生單電荷離子，分析的化合物分子量一般小于1000Da。Agilent1100LC/MSD

APCIIonSourceCoronaNeedleVaporizeintothegasphaseandionizethegaswithadischargeAPI-ESvs.APCIforTriamterene三氨蝶啶3.質(zhì)量分析器原理離子在磁場中的軌道半徑R取決于：m/z

、B

、U;■若加速電壓U和磁場強(qiáng)度B都一定時(shí)，不同m/z

的離子，由于運(yùn)動(dòng)的曲率半徑不同，在質(zhì)量分析器重彼此被分開，并記錄各m/z離子的相對(duì)強(qiáng)度;■固定R，B，連續(xù)改變加速電壓U，電場掃描法;■固定R，U，連續(xù)改變磁場強(qiáng)度B，磁場掃描法。加速后離子的動(dòng)能:在磁場存在下，帶電離子按曲線軌跡飛行,離心力=向心力:曲率半徑：質(zhì)譜方程式：單聚焦雙聚焦分析器離子源收集器磁場電場S1S2+-方向聚焦：

相同質(zhì)荷比，入射方向不同的離子會(huì)聚；能量聚焦：

相同質(zhì)荷比，速度(能量)不同的離子會(huì)聚；

質(zhì)量相同，能量不同的離子通過電場和磁場時(shí)，均產(chǎn)生能量色散；兩種作用大小相等，方向相反時(shí)互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)雙聚焦；四極質(zhì)量分析器

–

四極質(zhì)譜計(jì)

四極質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡單，價(jià)廉，體積小，易操作，無磁滯現(xiàn)象，掃描速度快，適合于GC-MS,LC-MS。分辯率不高。+ElectronBeamABCSampleinIonBeamquadrupolemassspectrometer離子漂移管-飛行時(shí)間質(zhì)譜計(jì)

（TimeofFlightMS,TOFMS）

TOFMS的核心部分是一個(gè)無場的離子漂移管

加速后的離子具有相同的動(dòng)能

m/z小的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度快，最先通過漂移管，到達(dá)檢測器。

m/z大的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度慢，最后通過漂移管，到達(dá)檢測器。

檢測通過漂移管的時(shí)間(t)及其相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度，可得到質(zhì)譜圖，t為或s數(shù)量級(jí)。

適合于生物大分子，靈敏度高，掃描速度快，結(jié)構(gòu)簡單，分辨率隨m/z的增大而降低。飛行時(shí)間質(zhì)量分析器讓離子飛傅立葉變換質(zhì)譜計(jì)

FourierTransform–MassSpectrometer,FT-MS

傅立葉變換質(zhì)譜計(jì)應(yīng)該是傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜計(jì)，是受FT-NMR的啟迪。利用不同m/z的離子，在磁場B的作用下，各自產(chǎn)生不同的回旋頻率。若施加一射頻場，使其頻率等于某一m/z離子的回旋頻率，則離子就會(huì)吸收能量而激發(fā)。

離子從射頻場吸收能量，稱之離子的回旋共振。

激發(fā)的離子運(yùn)動(dòng)速度(v)增大，運(yùn)動(dòng)軌道半徑(r)增大，稱之離子的回旋運(yùn)動(dòng)的激發(fā)。

如果磁場強(qiáng)度（B）一定，改變射頻場的頻率（）即可激發(fā)不同m/z的離子而得到質(zhì)譜。

FT-MS的核心為分析室，分析室由三對(duì)平行的極板構(gòu)成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋運(yùn)動(dòng)垂直于z軸，在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸方向垂直的兩極板上檢測信號(hào)。

FT-MS分辨率極高，目前可得到精確度最高的精確質(zhì)量。

FT-MS靈密度高，質(zhì)量范圍寬，速度快，性能可靠。

傅立葉變換質(zhì)譜計(jì)，中科院化學(xué)所（北京質(zhì)譜中心）離子阱質(zhì)量分析器

特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測器；特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單、易于操作、GC-MS聯(lián)用可用于m/z200-2000的分子分析。雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector).四極質(zhì)譜儀(Q).飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF).離子阱質(zhì)譜儀（TRAP）付利葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICR-MS).

┏四極+TOF（Q-TOF）串列式多級(jí)質(zhì)譜儀┫三重四極（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF穿越式四極桿，MS/MS是空間串聯(lián)離子阱，MS/MS是時(shí)間串聯(lián)獲得更多結(jié)果信息。串聯(lián)MS/MS的儀器從原理上可分為兩類串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS)

：

三重四極（QqQ）離子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器

MS1MS2Q1q2Q3選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子，進(jìn)入碰撞室，室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(碰撞氣體：N2、He、Ar、Xe、CH4等)，發(fā)生離子—分子碰撞反應(yīng)，從而產(chǎn)生‘子離子’，再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜，一般稱做CID(collision-induceddissociation)譜樣品導(dǎo)入毛細(xì)管，取樣錐、四極預(yù)桿

–

傳輸離子，從大氣壓到高真空狀態(tài)噴霧室-樣品霧化，離子化，去溶劑一級(jí)四極桿–

過濾母離子二級(jí)四極桿–

Ar碰撞誘導(dǎo)解離母離子三級(jí)四極桿–過濾子離子檢測器–檢測離子，產(chǎn)生質(zhì)譜信號(hào)真空泵–雙階分子渦輪泵串聯(lián)質(zhì)譜儀－三重四級(jí)桿更多的結(jié)構(gòu)信息，適合未知化合物的結(jié)構(gòu)解析（LC/MS/MS）共流出物，相同分子量的化合物提高信噪比——〉降低檢測限提高子離子的選擇性復(fù)雜基質(zhì)樣品分析，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性為什么需要MS/MS？IonIntensityABm/zB′A′掃描模式–FullScan（全掃描）MSModeQ1Q2Q3Fullscan(Q1)Fullscan(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmission可獲得豐富的譜圖信息適合未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定美國瓦里安掃描模式–SIM（選擇離子監(jiān)控）MSModeQ1Q2Q3Selectedionmonitoring(SIM)(Q1)Selectedionmonitoring(SIM)(Q3)=scanned;=selectedm/z;blank=completetransmission當(dāng)全掃描無法滿足靈敏度的要求時(shí)適合于基質(zhì)不是很復(fù)雜的樣品的定量分析掃描模式–SRM（選擇反應(yīng)監(jiān)控）MSModeQ1Q2Q3Selectedreactionmonitoring(SRM)Selectedreactionmonitoring(SRM)=scanned;=selectedm/z;=CID掃描模式–MRM（多級(jí)反應(yīng)監(jiān)控）MSModeQ1Q2Q3Multiplereactionmonitoring(MRM)Multiplereactionmonitoring(MRM)=scanned;=selectedm/z;=CIDSRM&MRM適合于較臟、基質(zhì)復(fù)雜的樣品，提高靈敏度適合于化合物結(jié)構(gòu)解析MRM掃描方式的特點(diǎn)多組分同時(shí)分析共流出物的分析母離子-子離子關(guān)系明確，定性能力強(qiáng)復(fù)雜樣品、臟樣品的分析同位素內(nèi)標(biāo)的使用可區(qū)分同分異構(gòu)體（多級(jí)反應(yīng)監(jiān)控）質(zhì)荷比:

離子質(zhì)量(以相對(duì)原子量單位計(jì))與它所帶電荷(以電子電量為單位計(jì))的比值,寫作m/z.峰:

質(zhì)譜圖中的離子信號(hào)通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度:

檢測器檢測到的離子信號(hào)強(qiáng)度.基峰:

在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強(qiáng)度最大的離子峰稱作基峰，并定強(qiáng)度100％?？傠x子流圖：準(zhǔn)分子離子、碎片離子、多電荷離子；同位素離子。在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強(qiáng)度的總和對(duì)時(shí)間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱TIC圖.4、質(zhì)譜術(shù)語指定某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的離子其強(qiáng)度對(duì)時(shí)間所作的圖.利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時(shí)是LC/MS測定中最有用的方式。當(dāng)樣品濃度很低時(shí)LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時(shí)，根據(jù)得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數(shù)值，觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖，檢驗(yàn)直接進(jìn)樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適，以后進(jìn)行MRM等其他掃描方式的測定時(shí)可作為參考。質(zhì)量色譜圖1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100質(zhì)量色譜圖總離子流圖氨基甲酸鹽化合物的總離子圖及提取離子譜圖600001200006000120007501500600012000100020002.557.51012.51517.515003000MSTICm/z163m/z116m/z222m/z202m/z226oxamylaldicarbaldicarbsulfonealdicarbsulfoxidecarbofurancarbarylmethiocarbpromecarb草氨酰涕滅威涕滅威砜涕滅威亞砜西維因猛殺威數(shù)學(xué)定義：

……(1)m1和m2代表兩個(gè)相鄰峰的質(zhì)量數(shù)

……(2)m代表某一峰的質(zhì)量，△m代表半峰寬分辨率一般低分辨儀器在2000左右。10000以上時(shí)稱高分辨。FT-MS分辨力可達(dá)2百萬。Massmeasurementaccuracydependsonresolution

02000400060008000Counts

2840

2845

2850

2855Mass(m/z)Resolution=14200Resolution=4500

Resolution=1810015ppmerror24ppmerror55ppmerrorHighresolutionmeansbettermassaccuracyExactmassofmostabundantisotope(monoisotpoic)C=12.0000,H=1.0078,N=14.0031,S=31.97211) [C24H19N]+:accuratemass:321.1513HRMS:AnExample=321/(321.1546-321.1513)=97,273MassspectrometerwithR?100,000candistinguishbetweenthesetwoions2) [C21H23NS]+:accuratemass321.1546R=M/ΔM不同儀器： 四極桿：4000Da

離子阱質(zhì)譜：4000Da

磁質(zhì)譜：10000Da

傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（FT-MS） 50000Da

飛行時(shí)間質(zhì)譜：無上限不同要求： 氣相色譜：800Da

液相質(zhì)譜：2000Da

生物分子：10000Da或更大質(zhì)量范圍質(zhì)譜儀所能測定的離子質(zhì)荷比的范圍分子離子:M+·,M-e→M+·

z=1時(shí)，其m/z等于天然豐度最大的同位素的原子量之和。

碎片離子：廣義上指除分子離子以外的所有離子。

重排離子：經(jīng)過重排，斷裂一個(gè)以上化學(xué)鍵所生成的離子。

母離子與子離子：任何一個(gè)離子進(jìn)一步裂解為質(zhì)荷比較小的離子，前者是后者的母離子或前體離子，后者是前者的子離子。質(zhì)譜中的離子

奇電子離子OE+·：帶單電荷的離子，如M+·,A+·,C+····在質(zhì)譜解析中，奇電子離子很重要，因質(zhì)荷比較小的奇電子離子是由質(zhì)荷比較大的奇電子離子裂解生成的。偶電子離子EE+：帶雙電荷的離子，如B+,D+,E+,···

多電荷離子：如z=2的離子，存在于穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)中。

準(zhǔn)分子離子：[MH]+,[M-H]+同位素離子：非單一同位素的元素在電離過程中產(chǎn)生同位素離子，同位素離子構(gòu)成同位素峰簇。

亞穩(wěn)離子

離子在離子源的運(yùn)動(dòng)時(shí)間106s數(shù)量級(jí),壽命<106s的離子在離子源內(nèi)進(jìn)一步裂解。離子從離子源到達(dá)檢測器的時(shí)間為105s數(shù)量級(jí)，離子壽命>105s，足以到達(dá)檢測器。

壽命106-105s的離子，從離子源出口到達(dá)檢測器之前裂解并被記錄的離子稱亞穩(wěn)離子，以m*表示.m*=m22/m1

亞穩(wěn)離子的峰有不同程度的擴(kuò)散，達(dá)2~3質(zhì)量單位，這是因?yàn)閙1+裂解時(shí)，部分內(nèi)能轉(zhuǎn)化為動(dòng)能。

在質(zhì)譜解析中，m*可提供前體離子和子離子之間的關(guān)系。(1)確定分子離子,即確定分子量氮規(guī)則：含偶數(shù)個(gè)氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是偶數(shù)，含奇數(shù)個(gè)氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是奇數(shù)。與高質(zhì)量碎片離子有合理的質(zhì)量差，凡質(zhì)量差在3~8和10~13，21~25之間均不可能，則說明是碎片或雜質(zhì)。5、如何看質(zhì)譜圖：高分辨質(zhì)譜可以由分子量直接計(jì)算出化合物的元素組成從而推出分子式低分辨質(zhì)譜利用元素的同位素豐度，例:(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學(xué)式豐度大反映離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強(qiáng)，含支鏈的地方易斷，這同有機(jī)化學(xué)基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。(3)峰強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系不同類型有機(jī)物有不同的裂解方式相同類型有機(jī)物有相同的裂解方式,只是質(zhì)量數(shù)的差異需要經(jīng)驗(yàn)記憶。(適于低分辨小分子譜圖,若已經(jīng)是高分辨質(zhì)譜圖得到元素組成更好)(1)核對(duì)獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當(dāng)。(2)綜合樣品其他知識(shí)：例如熔點(diǎn)，沸點(diǎn)，溶解性等理化性質(zhì)，樣品來源，光譜，波譜數(shù)據(jù)等.6、質(zhì)譜解析的一般步驟(3)盡可能判斷出分子離子。(4)假設(shè)和排列可能的結(jié)構(gòu)歸屬：高質(zhì)量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(5)假設(shè)一個(gè)分子結(jié)構(gòu)，與已知參考譜圖對(duì)照，或取類似的化合物，并作出它的質(zhì)譜進(jìn)行對(duì)比。優(yōu)點(diǎn):(1)定分子量準(zhǔn)確，其它技術(shù)無法比。(2)靈敏度高，常規(guī)10-7—10-8g,單離子檢測可達(dá)10-12g。(3)快速，幾分甚至幾秒。(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對(duì)于難分離的混合物特別有效,其它技術(shù)無法勝任。(5)多功能，廣泛適用于各類化合物。有機(jī)質(zhì)譜的特點(diǎn)(1)異構(gòu)體，立體化學(xué)方面區(qū)分能力差。(2)重復(fù)性稍差，要嚴(yán)格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動(dòng)手，須專人操作。(3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，污染等問題。(4)價(jià)格稍顯昂貴，操作有點(diǎn)復(fù)雜。局限性三、LC-MS對(duì)于揮發(fā)性化合物的分析，氣相色譜（GC）是關(guān)鍵的分離技術(shù)，對(duì)于極性和高分子量化合物，液相色譜（LC）則是其關(guān)鍵的分離技術(shù)。與GC不同，LC缺乏靈敏和選擇性（乃至特異性）的檢測器。大多數(shù)通用的檢測器或靈敏度不高（例如折光指數(shù)檢測器，光散射檢測器或熒光檢測器），或在犧牲靈敏度的情況下有一定程度的選擇性（例如二極管陣列檢測器）。色譜有超強(qiáng)分離能力，質(zhì)譜高靈敏（還定性）。

1、發(fā)展LC-MS的動(dòng)力要求發(fā)展能將這兩個(gè)特點(diǎn)結(jié)合起來的LC聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜分析儀(MS)需要高真空條件質(zhì)量分析系統(tǒng)最好使用揮發(fā)性緩沖液液相(HPLC)高效分離混合物流動(dòng)相揮發(fā)后產(chǎn)生大量氣體出口壓力為大氣壓無質(zhì)量限制可以使用緩沖鹽溶液

液相(HPLC)到質(zhì)譜(MS)的接口HPLCMSInterface(KeytoSuccess!)傳統(tǒng)的HPLC系統(tǒng)中遇到的流量（0.5～2mL/min的正、反相溶劑流速）和質(zhì)譜儀要求的真空之間存在的難以協(xié)調(diào)性似乎太大了。長期以來，LC與MS聯(lián)用被認(rèn)為是“不可能的結(jié)合”

為了克服這一明顯的不相容問題，在過去20年中已發(fā)展了幾種不同的接口。將流量達(dá)2mL/min的液體引進(jìn)MS的真空系統(tǒng)需要使用一個(gè)合適的接口傳送帶(movingbelt)式的LC-MS:目前已經(jīng)停用熱噴霧(TSP)LC-MS接口:已經(jīng)很少使用粒子束(PBI)大氣壓電離源(API):目前最常用的方法電噴霧(ESI)大氣壓化學(xué)電離源(APcI)2、LC-MS的接口的發(fā)展和種類NeutralMoleculesAnalyteIonsClustersSalts毛細(xì)管液相的入口霧化器加熱

N2霧化氣入口碎片碰撞電壓(CID)錐孔八極桿四極桿高能打拿極/電子倍增器+++++透鏡+++++++++++++液質(zhì)聯(lián)用的電噴霧(ESI)接口毛細(xì)管碎片碰撞電壓（CID）Coronaneedle++++++++++++錐孔透鏡四極桿++++八極桿熱氮?dú)庖嘿|(zhì)聯(lián)用的大氣壓化學(xué)電離源(APCI)接口高能打拿極/電子倍增器加熱氣化電暈放電針LC/MS聯(lián)用技術(shù)的相對(duì)適用范圍大氣壓電噴霧質(zhì)譜應(yīng)用范圍大氣壓電噴霧源大氣壓化學(xué)源分子量化合物極性1000100,00010,000非極性極性化合物氣相色譜/質(zhì)譜大氣壓離子化技術(shù)電噴霧(ESI)化合物無需具有揮發(fā)性是分析熱不穩(wěn)定化和物的首選方法離子在溶液中以已生成除了生成單電荷離子之外還可以生成多電荷離子大氣壓化學(xué)電離源(APCI)化和物需具有一定的揮發(fā)性化和物必需是熱穩(wěn)定的離子在氣態(tài)條件中生成只生成單電荷離子農(nóng)藥及殘留化合物多肽及蛋白的分子量測定確定氨基酸序列多肽及蛋白的純度分析單糖和多糖的結(jié)構(gòu)分析中極性到高極性,包括離子化合物的分析,如表面活性劑分析電噴霧(ESI)和大氣壓化學(xué)離子化(APCI)農(nóng)藥及殘留化合物抗生素堿性藥物小分子量樣品類固醇,雌激素單磺酸偶氮染料ESIAPCI

（1）.接口的選擇：

ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）

APCI不適合可帶多個(gè)電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。3、LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化①電離方式

ESI采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離，而APCI電離是放電探針促使溶劑和其它反應(yīng)物電離、碰撞及電荷轉(zhuǎn)移等方式形成了反應(yīng)氣等離子區(qū)，樣品分子通過等離子區(qū)時(shí)，發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移。②樣品流速

APCI源允許的流量相對(duì)較大，0.2-2mL/min，而ESI源允許流量相對(duì)較小，最大只能為1.0mL/min。③斷裂程度

APCI源的探頭處于高溫，可使熱不穩(wěn)定的化合物分解，產(chǎn)生碎片；ESI源探頭處于常溫，常生成分子離子峰，不易產(chǎn)生碎片。④靈敏度都很高。ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性小的化合物。⑤多電荷

APCI源不能生成一系列多電荷離子，所以不適合分析生物大分子。而ESI源特別適合于蛋白質(zhì)、多肽類的生物分子，由于它能產(chǎn)生一系列的多電荷離子。

選擇的一般原則為：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對(duì)樣品加以酸化。負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化。（2）.正、負(fù)離子模式的選擇：常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。LC／MS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/l。含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10-5mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。（3）.流動(dòng)相的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul／min，應(yīng)用4.6mm內(nèi)徑LC柱時(shí)要求柱后分流，。為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱，這對(duì)于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時(shí)間。（4）流量和色譜柱的選擇

霧化氣對(duì)流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級(jí)質(zhì)譜的產(chǎn)生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20℃左右即可。對(duì)熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時(shí)還要考慮流動(dòng)相的組成，有機(jī)溶劑比例高時(shí)可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的。（5）輔助氣體流量和溫度的選擇從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對(duì)分析結(jié)果的干擾。要求獲得最佳的分析結(jié)果，從ESI電離的過程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競爭，不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。（6）樣品的預(yù)處理：4、推薦維護(hù)日程每日維護(hù)-使用前檢查檢查氬氣和氮?dú)鈮毫?/p>

氮?dú)?/p>

:純度(＞99%)

壓力Gaspressure:690±140kPa(100±20psi),0.4~0.6MPa

氬氣:超高純Ultra-highpurity(>99.995%)

壓力Gaspressure:135±70kPa(20±10psi),<0.15Mpa檢查離子規(guī)壓力，確認(rèn)真空系統(tǒng)處于可操作狀態(tài)，小于6×10-6Torr

3.移走離子傳輸毛細(xì)管入口上的保護(hù)墊或放電針，重新檢查前級(jí)泵(1.0~2.0Torr)，和離子規(guī)壓力，確認(rèn)真空系統(tǒng)在可操作條件。

4.檢查溫度(≤46℃)和濕度(40~60%)；

5.檢查數(shù)據(jù)系統(tǒng)的磁盤空間

三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀

Thermofishersci.推薦維護(hù)日程沖洗樣品管路和大氣壓電離探針（電噴霧和大氣壓化學(xué)電離）；設(shè)定系統(tǒng)在待機(jī)狀態(tài)；清洗離子吹掃錐和離子傳輸毛細(xì)管；設(shè)定離子傳輸毛細(xì)管溫度200℃;使用真空隔離墊或者放電針堵上離子傳輸毛細(xì)管口;

廢液瓶廢液倒掉;每日維護(hù)-使用后維護(hù)如何沖洗樣品傳輸管路等？（ESI模式下）按以下步驟設(shè)定ESI參數(shù)

設(shè)定噴霧電壓為0設(shè)定鞘氣流速為30設(shè)定輔助氣流速為5設(shè)定流動(dòng)相為水和甲醇50：50，開啟液相泵使流動(dòng)相