天然產(chǎn)物分離綜述

四川大學(xué)碩士研究生課程考試試卷姓名冉艷學(xué)院華西藥學(xué)院學(xué)號」 專業(yè)藥物化學(xué)任課教師 陳東林 課程名稱 天然產(chǎn)物分離技術(shù)課程成績 考試時間 2011年12月天然產(chǎn)物分離技術(shù)與方法摘要:本文概述了天然產(chǎn)物分離提純的各種分離方法，簡單介紹了各種方法的原理特點(diǎn)，并以生物堿為例，介紹了各種方法在生物堿分離提純中的運(yùn)用。關(guān)鍵詞：生物堿；分離方法；特點(diǎn)生物堿廣泛分布于多種植物中,絕大多數(shù)具有顯著生理活性。生物堿一般指存在于生物體內(nèi)的堿性含氮化合物，多數(shù)具有復(fù)雜的含氮雜環(huán)，有堿性和顯著的生理活性。其種類很多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,共性是具有一定的堿性,可與酸成鹽。一些生物堿因具有抗腫瘤、抗癌、低毒、低成本的特點(diǎn)，最近已成為人們研究的焦點(diǎn)。科學(xué)、高效地從植物中提取和分離純化生物堿成分是擴(kuò)大其實(shí)際應(yīng)用的核心問題［1］。分離純化生物堿的方法有很多，筆者參考了近年來發(fā)表的有關(guān)天然產(chǎn)物分離純化的分離技術(shù)文獻(xiàn)，包括大孔吸附樹脂、超臨界流體、分子印跡技術(shù)、分子蒸餾、高速逆流色譜、高效液相色譜、離心分配色譜、真空液相層析等8種分離方法，比較各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為天然產(chǎn)物生物堿分離技術(shù)的發(fā)展提供參考。1大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂的概況大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑,具有很好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積,可通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物。大孔吸附樹脂具有良好的吸附性能,主要應(yīng)用于工業(yè)脫色、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。近年來,大孔吸附樹脂已廣泛應(yīng)用于天然植物中活性成分,如苷類、黃酮、生物堿等大分子化合物的提取分離。對環(huán)烯醚萜苷、芍藥苷、威靈仙總皂苷、淫羊藿黃酮、銀杏總黃酮、延胡索生物堿、荷葉堿、多種天然色素、中藥復(fù)方藥物提取以及抗生素、維生素等生物化學(xué)制品的吸附分離都有良好的效果［2］。大孔吸附樹脂的性能大孔吸附樹脂是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu),其性質(zhì)介于天然吸附劑（活性炭、硅膠和硅藻土）和離子交換劑之間,吸附特性與天然吸附劑類似,比離子交換劑更容易再生。大孔吸附樹脂優(yōu)點(diǎn)如下:（1）選擇性良好,無機(jī)鹽的存在有利于吸附；（2）分離和濃縮有機(jī)物,得到的化合物灰份低；(3)物理化學(xué)穩(wěn)定性高,不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑,機(jī)械強(qiáng)度好;(4)吸附和解吸較快,吸附容量大；(5)品種規(guī)格多,可根據(jù)化合物的性質(zhì)來選擇適當(dāng)結(jié)構(gòu)或極性的吸附劑；⑹吸附樹脂呈小球狀，直徑為0.2?0.8mm,因此流體阻力比活性炭小,流速較快［2］。1.3大孔吸附樹脂的分離原理大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩性原理相結(jié)合的分離材料。吸附樹脂表面上的原子力場不飽和，有表面能，因而可以吸附某些分子以降低表面能。其吸附性是范德華引力或產(chǎn)生氫鍵的結(jié)果，分子篩性是由其本身多孔性結(jié)構(gòu)決定的。大孔吸附樹脂可以有效地吸附具有不同化學(xué)性質(zhì)的各種類型化合物，其吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質(zhì)，即表面的親水性或疏水性決定了它對不同有機(jī)化合物的吸附特性。根據(jù)大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)表面不帶或帶有不同極性的功能基，可分為非極性、中極性和極性三類，它們的結(jié)構(gòu)特性和吸附性各異。非極性吸附樹脂是由偶極距很小的單體聚合制得，不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)，可通過與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物。極性吸附樹脂是指含酰胺基、氰基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹脂，通過靜電相互作用吸附極性物質(zhì)。中極性的吸附樹脂是含酯基的吸附樹脂，其表面兼有疏水和親水兩部分。一般來說，非極性樹脂在極性溶劑(加水)中吸附非極性物質(zhì)，極性樹脂則易在非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，中極性樹脂既可在極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可在非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)［2］。1.4大孔吸附樹脂在生物堿分離中的應(yīng)用分離生物堿可用陽離子交換樹脂，但洗脫時需用酸、堿或鹽類洗脫劑，這將會給后面的分離造成麻煩，而用吸附樹脂可避免引入外來雜質(zhì)的問題。趙駿等利用4種型號的大孔吸附樹脂純化荷葉生物堿，D-101型大孔吸附樹脂對荷葉生物堿的比吸附量最大，采用梯度洗脫可使荷葉堿產(chǎn)率達(dá)0.8%，產(chǎn)品純度(重量百分比)在50?70%之間［3］。劉俊紅等將3種大孔吸附樹脂應(yīng)用于延胡索生物堿的提取分離，吸附的生藥量為樹脂的1倍，用兩倍樹脂量的95%乙醇能基本洗脫完全，對于優(yōu)化生產(chǎn)工藝具有一定的參考價(jià)值［4］。2分子印技術(shù)2.1分子印技術(shù)的概況分子印跡技術(shù)(Molecularimprintingtechnology,MIT)又稱為分子烙印技術(shù)，屬于高分子化學(xué)、材料科學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)等之間的一個交叉學(xué)科領(lǐng)域。分子印跡技術(shù)是為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合點(diǎn)位上與某一分子(通常稱為模板分子)完全匹配的聚合物的實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)。分子印跡聚合物(Molecularimprintingpolymer,MIPs)是指以目標(biāo)分子為模板分子，將具有結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的功能化聚合物單體通過共價(jià)或非共價(jià)的方式與模板分子結(jié)合，加入交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)完成后將模板分子提取出來后形成的一種有固定空穴大小和形狀及有確定排列功能團(tuán)的交聯(lián)高聚物。分子印跡技術(shù)之所以發(fā)展如此迅速，主要是因?yàn)樗哂蓄A(yù)定性(Predetermination)、識別性(Recognition)和實(shí)用性(Practicability)。由于MIPs具有抗惡劣環(huán)境的能力，表現(xiàn)出穩(wěn)定性強(qiáng)和使用壽命長等優(yōu)點(diǎn)，因此對其合成及應(yīng)用研究十分活躍，涉及的范圍很廣，如手性物質(zhì)分離，生物傳感器，模擬抗體與受體，模擬酶催化，氨基酸及多肽等生物大分子、金屬離子、藥物分子、天然產(chǎn)物等的分離與純化［1］。分子印技術(shù)的基本原理在一定溶劑(也稱致孔劑)中，模板分子與功能單體依靠官能團(tuán)之間的共價(jià)或非共價(jià)作用形成主客體配合物；然后加入交聯(lián)劑，通過引發(fā)劑引發(fā)進(jìn)行光或熱聚合，使主客體配合物與交聯(lián)劑通過自由基共聚合在模板分子周圍形成高聯(lián)的剛性聚合物；最后將聚合物中的印跡分子洗脫或解離出來。這樣在聚合物中便留下了與模板分子大小和形狀相匹配的立體孔穴，同時孔穴中包含了精確排列的與模板分子官能團(tuán)互補(bǔ)的由功能單體提供的功能基團(tuán)，如果構(gòu)建合適，這種分子印跡聚合物就象鎖一樣對此鑰匙具有選擇性。這便賦予該聚合物特異的“記憶”功能，即類似生物自然的識別系統(tǒng)，這樣的空穴將對模板分子及其類似物具有選擇識別特性［1］。分子印技術(shù)在生物堿分離純化中的應(yīng)用近年來生物堿類活性成分的提取已成為分子印跡技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Mosbach等在1993年首次利用藥物茶堿與甲基丙烯酸(MA)之間可氫鍵鍵合，制成了藥物茶堿分析用色譜固定相。由此方法已合成了對藥物、生物活性物質(zhì)、酶等有識別功能的樹脂、凝膠固定相等高分子材料，使分子烙印從最初的手性體分離材料制備和手性體分離這一單一應(yīng)用范圍迅速地?cái)U(kuò)展到化學(xué)、生物、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域［5］。陳移姣等以咖啡因?yàn)槟０宸肿?，采用水溶液懸浮聚合法制備了用于色譜分離（作HPLC的固定相）的微米級分子印跡聚合物微球（MIPMs）。結(jié)果表明當(dāng)以茶葉堿為競爭分子時，MIPMs對咖啡因有強(qiáng)的吸附和特異性選擇識別能力，能滿足茶葉中咖啡因分離富集的需要，這為在天然物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)低、藥效高的成分的鑒定分析和分離純化提供了方法借鑒［6］。張靜等以士的寧為模板分子，采用原位分子印跡技術(shù)，合成了士的寧分子印跡整體柱。通過優(yōu)化合成條件，確定了模板分子、功能單體與交聯(lián)劑之間的比例以1：4：16最佳；對士的寧整體柱的色譜條件包括流動相組成、流速、柱溫等進(jìn)行了考察，并用于士的寧和馬錢子堿的分離，其分離因子為3.5⑺。Lai等以苦參堿為模板制作了分子印跡膜，從槐屬植物苦參中提取分離苦參堿。結(jié)果分子印跡膜對苦參堿的回收率可達(dá)到71.4%［8］。以上研究結(jié)果表明，分子印跡膜的最大特點(diǎn)就是對模板分子的識別具有可預(yù)見性，對于特定物質(zhì)的分離極具針對性。其中分子印跡復(fù)合膜又將膜分離的可連續(xù)化操作特點(diǎn)與分子印跡技術(shù)進(jìn)行了結(jié)合，是最有應(yīng)用前景的一種膜技術(shù)。3高效液相色譜3.1高效制備液相色譜的工作原理及特點(diǎn)HPPC的原理是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異,使它們以不同程度分布在兩個不相溶的相中,且各組分可在兩相的相對運(yùn)動過程中,在兩相中發(fā)生多次分布，從而達(dá)到分離的目的。與其它分離手段相比，HPPC具有以下特點(diǎn)：（1）采用高柱效色譜柱,其填料多為細(xì)顆粒多孔材料,分離效率高；（2）應(yīng)用范圍廣泛，對極性和非極性、離子型和非離子型、小分子和大分子、熱穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性化合物均具有較好的分離效果；（3）根據(jù)所分離化合物的理化性質(zhì)可配備不同類型的檢測器，如紫外檢測器（UV）、二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器（FD）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）等，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定可靠的在線檢測；（4）可連續(xù)自動化操作［9］。3.2高效液相色譜在生物堿分離純化中的應(yīng)用Mueller等［io］采用多種型號的制備色譜柱，以甲醇-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫,從生長于澳大利亞的植物Mitrephoradiversifolia中分離得到了抗瘧藥芴酮生物堿。艾秀珍［ii］等對辣椒精進(jìn)行預(yù)處理，先制得白色辣椒堿類化合物，再用適量流動相溶解，采用自裝ODSC18柱（200mmX10.0mm，25?4O.m）對其進(jìn)行純化。確定的操作工藝為：流動相為甲醇-水（75#25）,辣椒堿類化合物進(jìn)樣質(zhì)量濃度為180g.L-1,進(jìn)樣體積為2.08mL,流速為4.0mLmin-i。得到的辣椒堿單體純度為95.23%,回收率為93.27%,產(chǎn)率為4.38g.L-i.h-i,單位產(chǎn)品流動相消耗為0.087L.g-i。邊清泉［12］在從喜樹堿提取物中分離制備喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品時，所用的色譜柱Shim.packPREP.ODS(H)KIT(250mmx20mm),流動相為甲醇-水-異丙醇(6:3.8:0.2),流速為10mL.min-i,產(chǎn)品純度達(dá)99.64%。4高速逆流色譜4.1高速逆流色譜概況高速逆流色譜(high-speedcountercurrenthromatography,HSCCC)是一種連續(xù)高效的液－液分配色譜分離技術(shù)。該技術(shù)由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn),因而避免了因不可逆吸附引起的樣品損失、失活、變性等問題,特別適合于天然生物活性成分的分離。而且由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸,使得樣品的制備量大大提高,是一種理想的制備分離手段,因此此項(xiàng)技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于中藥成分分離、保健食品、生物化學(xué)、生物工程、天然產(chǎn)物化學(xué)、有機(jī)合成、環(huán)境分析等領(lǐng)域［⑶。4.2高速逆流流色譜的分離原理高速逆流色譜分離原理是利用螺旋柱在高速行星運(yùn)動時產(chǎn)生的巨大離心力使螺旋柱中互不相溶的兩相不斷混合,達(dá)到一種特殊的流體動力學(xué)平衡———單向流體動力學(xué)平衡,此時在螺旋柱中任何一部分,兩相溶劑都反復(fù)進(jìn)行著混合和靜置的分配過程，這一過程頻率極高，當(dāng)柱心以800r/min旋轉(zhuǎn)時，頻率超過每秒13次。流動相不斷地穿過固定相,同時保留其中的一相(固定相),利用恒流泵連續(xù)泵入另一相(流動相)，流動相載著溶質(zhì)(樣品)進(jìn)入螺旋柱并不斷反復(fù)穿過固定相，使樣品在兩相之間不斷反復(fù)地進(jìn)行分配，由于樣品中各組分在兩相中分配系數(shù)不同，導(dǎo)致在螺旋柱中的移動速度不同，因而能使樣品各組分按分配系數(shù)的次序，依次得到分離。4.3高速逆流流色譜的特點(diǎn)高速逆流色譜技術(shù)的特點(diǎn)有以下幾點(diǎn)：a.操作簡單易行。傳統(tǒng)的制備方法，如重結(jié)晶、柱層析和高效液相色譜(制備型)，操作周期長且步驟繁瑣，HSCCC無需對樣品進(jìn)行復(fù)雜的處理，出峰可以在線檢測，且可以和靈敏度高的檢測技術(shù)聯(lián)用，方便、快捷、準(zhǔn)確。b.應(yīng)用范圍很廣。HSCCC中使用的兩相溶劑體系組成可以是任意的，故可以適用于各種極性范圍的化合物的分離。C.無需固體載體。由于不使用固體載體，所以樣品不會出現(xiàn)不可逆吸附、污染、失活、變性、以及峰形拖尾等現(xiàn)象。因此HSCCC在經(jīng)過多次重復(fù)分離均可以實(shí)現(xiàn)較好的重現(xiàn)性以及得到較高的回收率。d.產(chǎn)品純度高。選擇正確的溶劑體系，可以將樣品分離后得到高于90%純度的產(chǎn)品。e.適用于制備型分離。4.4高速逆流色譜在生物堿分離純化中的應(yīng)用近年來，用HSCCC已成功分離了多種生物堿。分離生物堿成分常用的溶劑體系主要有正己烷-乙酸乙酯-甲醇(或者乙醇、正丁醇)-水體系和三氯甲烷-甲醇-水體系。如LiuR以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5：5：7：5)為溶劑體系，從吳茱萸中分離出5種生物堿［14］。TangQF用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/LHCl(1：3.5：2：4.5)從黃花烏頭中分離出6種生物堿［15］。5離心分配色譜5.1離心分配色譜概況離心分配色譜技術(shù)(centrifugalpartitionchromatography,簡稱CPC)屬于現(xiàn)代逆流色譜技術(shù)的一種。廣義上講，它和滴流逆流色譜(DCCC)、旋轉(zhuǎn)腔室逆流色譜(RLCCC)以及回旋腔室逆流色譜(GLCCC)等同屬于非螺線管式的逆流色譜。值得一提的是，國內(nèi)文獻(xiàn)通常所說的高速逆流色譜裝置(HSCCC)多是專指基于多層螺線管行星式離心運(yùn)動的色譜設(shè)備(國外有文獻(xiàn)為與離心分配色譜CPC相區(qū)別而稱之為CCC設(shè)備)，它與離心分配色譜最明顯的差異是：前者通過螺線管的行星式運(yùn)動(自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn))來實(shí)現(xiàn)固定相的保留和兩相的有效混合和傳質(zhì)；后者通過離心力場的作用在分配槽(channel)中保留固定相，并實(shí)現(xiàn)兩相間的有效接觸和傳質(zhì)［16］。離心分配色譜以其高效率和無固相吸附劑污染等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物粗提物的進(jìn)一步分離提純中。5.2離心分配色譜在生物堿分離提純中的作用為簡明起見，將CPC用于天然產(chǎn)物中生物堿分離提純的一些例子列于表2中。表中的溶劑比均為體積比。更為具體的操作步驟和條件可以查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，這里不再詳細(xì)說明。表1CPC冃Fm物謚分禽賓創(chuàng)天黠原斛分離，握縄產(chǎn)物1OH竦遵花歆込ixjplu昂“明根展異隹嗆猱(Litiiiinc;} GpH區(qū)帶精虬上升式注廉甲基叔丁葛SJ-緲?biāo)甶d"團(tuán)花tAillho'q^iiihisrudjjiibhii分離兩種啣嗥類生翳的1升法椀脫甲醇-水你3)Sbod5ilinigL?護(hù)亂李科嗣倉禪厲程柯馬甲了i' rmnwinriJK的莖環(huán)駄生柳槪1升法撫脫Mtt-甲醇-欣的乙斛^5531Rrrivul李叫底毋花{(JltllH仙ith呼H3悅春里寧tvnthIrnin^)、氏春花堿]luuiud]\u\r.\和檢春堿〔vb罠山」此ki>bljbvlin^lpH扛帶常軸上升法嶷蠱甲墓叔T墓陀-乙1卜水(4r5i6真空液相層析6.1真空液相層析的定義真空液相層析(VacuumLiquidChromatography簡稱VLC)是近年來在國外化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中迅速發(fā)展起來的一種新的層析技術(shù),它是利用柱后減壓,使洗脫液迅速通過固定相,從而很好地分離樣品。真空液相層析具有快速、簡易、高效、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn),目前已成功地用于萜類、木脂素、生物堿等生物活性天然產(chǎn)物的分離。6.2真空液相層析的特點(diǎn)真空液相層析每收集一個流分均需將柱子抽干,相當(dāng)于綜合了制備薄層色譜(PTLC)和真空抽濾技術(shù)。由于固定相顆粒細(xì)小,表面積較大,裝柱合理,加上真空抽濾使移動相快速通過柱子,分離速度快,一般幾小時即可完成。由于減少了渦流與擴(kuò)散現(xiàn)象,分離效果較好。真空液相層析不同于常壓柱層析和快速柱層析,后者洗脫劑是連續(xù)的,在操作過程中不能間斷,而且快速柱層析采用柱前加壓,比較而言真空液相層析所用設(shè)備極其簡單、便宜,操作方便。同時,真空液相層析處理樣品量可大可小。幾十克的樣品仍能以較快的速度完成。在快速柱層析中，由于受玻璃柱的限制，處理6g以上的樣品時非常困難。常壓柱雖然沒有樣品量的限制,但極其耗時,固定相和溶劑用量較大,分離效果也由于樣品渦流與擴(kuò)散現(xiàn)象較嚴(yán)重而大打折扣。真空液相層析尤其適用于頻繁的梯度淋洗。流動相的選擇與一般柱層析相同，即先用TLC來選擇條件。一般先用極性小的溶劑(如石油醚),然后逐步增加洗脫液的極性。極性溶劑的增加開始時較慢(如按1%,2%,3%遞增),然后較快(5%,10%,20%,50%)直至100%。當(dāng)然VLC法也有不足之處，在使用低沸點(diǎn)熔劑(如石油醚)時，要嚴(yán)格控制好真空度,防止大量溶劑揮散。6.3真空液相層析在生物堿分離提純中的作用采用真空液相層析可快速將烏頭中二萜生物堿分離純化。如Aconitumcolumbianum提取物中pH9?12的生物堿混合物(lg)經(jīng)真空液相層析(氧化鋁60),甲苯-氯仿1.4洗脫得到265mgtalatizamine(4)，再用氯仿-甲醇19.1洗脫可得到247mgcammaconine(5)［⑺。7結(jié)語天然產(chǎn)物分離和純化技術(shù)由于對象品種多，而技術(shù)多樣化。天然產(chǎn)物分離純化技術(shù)發(fā)展很快，不斷融入新的技術(shù)如分子精餾、分子印跡等［18］。中國天然產(chǎn)物的分離和純化技術(shù)還比較落后，和國外差別較大，特別是制備色譜等高純度制備分離技術(shù)，導(dǎo)致中國目前依然是粗產(chǎn)品加工為主。因此新型分離純化技術(shù)的研究特別是一些平臺技術(shù)如制備色譜等對中國中藥現(xiàn)代化和新藥開發(fā)有重要意義。參考文獻(xiàn)：[1]楊鑫,張華,董愛軍,張英春,趙海田,姚磊,佘永新,王靜.分子印跡技術(shù)在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,42(8):146?153劉飛,趙瑩.大孔吸附樹脂及其在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用[J].齊魯藥事，2008,27(10):679?681趙駿,李小年.利用大孔吸附樹脂純化荷葉生物堿.中藥材,2003,26(9):669?670劉俊紅,魏峻峰,王洪志等.大孔吸附樹脂在延胡索生物堿提取分離中的應(yīng)用.中草藥,2002,33(1):37?38VlatakisG,AnderssonLI,MosbachK,etal.Drugassayusingantibodymimicsmadebymolecularimprinting[J].Nature,1993,361(6413):645-246.陳移姣,周興國,李桂玲.懸浮聚合法制備咖啡因分子印跡聚合物微球及其性能研究[J].中草藥,2005,36(5):692-695.張靜，賀浪沖，傅強(qiáng).體液中微量士的寧的富集及同時檢測[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2005,21(1):36-38.LaiJP,HeXW,JiangY,etal.PreparativeseparationanddeterminationofmatrinefromtheChinesemedicinalplantSophoraflavescensAitbymolecularlyimprintedsolidphaseextraction[J].AnalBioanalChem,2003,375(2):264-269.陳鴛誼，李行諾，張翠萍,顏繼忠?高效制備液相色譜在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用J].藥學(xué)進(jìn)展，2010,34(8):337?343[10]MuellerD,DavisRA,DuffyS,etal.AntimalarialactivityofazafluorenonealkaloidsfromtheAustraliantreeMitrephoradiversifolia[J].JNatProd,2009,72