乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測

乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的監(jiān)測

繆曉輝2009.5一、HBV耐藥的有關定義二、各種耐藥檢測技術的評價三、需要重視的幾個問題一、HBV耐藥的有關定義

病毒學突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化學突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐藥（genotypicresistance）HBV表型耐藥（phenotypicresistance）臨床耐藥（clinicalresistance）HBV耐藥的有關定義

病毒學突破（virologicbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA水平與最低值相比上升或超過1個log10（10倍）。HBV耐藥的有關定義

病毒反跳（viralrebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。

HBV耐藥的有關定義

生化學突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平一度復常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關定義

HBV基因型耐藥（genotypicresistance）指HBV基因組中的某些位點發(fā)生改變，導致這種藥物對HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關系，通過這些變異位點的檢測可判斷HBV有無耐藥性。HBV耐藥的有關定義

HBV表型耐藥（phenotypicresistance）通過體外細胞培養(yǎng)方法，直接測定HBV對某種藥物的敏感性，或者在體外直接測定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來評估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐藥IC50

＞10倍:耐藥HBV耐藥的有關定義

臨床耐藥（clinicalresistance）指臨床出現(xiàn)病毒復制不能被抑制，或HBV復制一度被抑制后又出現(xiàn)HBVDNA反跳，同時伴有ALT升高，或肝炎復發(fā)的其他臨床證據(jù)。二、各種耐藥檢測技術及評價病毒學反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測HBV表型耐藥檢測臨床耐藥監(jiān)測病毒學反跳或突破的監(jiān)測基于對血清HBVDNA載量的動態(tài)監(jiān)測需重視以下三點：1.HBVDNA載量檢測手段的敏感性2.檢測技術的可靠性和穩(wěn)定性3.監(jiān)測的間隔時間HBV基因型耐藥監(jiān)測時機非必須不主張常規(guī)、廣泛應用基因型耐藥相關變異的命名基因型耐藥相關變異

在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐藥的主要技術堿基序列分析法直接測序克隆測序聚合酶鏈式反應及限制性片段長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP)反向雜交分析技術（INNO—LiPA）基因芯片技術實時熒光定量PCR技術探針定點突變PCR技術引物末端堿基定點突變擴增技術熔解曲線法基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)直接測序法末端終止法化學裂解法DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應用廣泛。不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。①簡便、快速、準確可靠。②安全、無放射性污染。③模板用量大大減少。④測序能力增強。HBVYMDD變異直接測序結果圖譜直接DNA測序的局限性1.設備貴、技術高、耗材、費時。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%時，由于競爭抑制作用不能被擴增。直接測序法檢測HBVYMDD變異1.JPG克隆測序法克隆測序法優(yōu)點：1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株之間的相對比。2.提高了檢測的靈敏度。局限性：1.技術難度較高。2.檢測周期更長。3.檢測的費用大大增加。堿基變噴異可能氏導致：①原有謎位點消失②產(chǎn)磚生新的舌位點③識餃別位點著移位利用錯配吊引物使漫P虧CR產(chǎn)物凍中產(chǎn)生禾特襲異的酶切杰位點結果:寄酶切恐片段長件、短變散化和多貍、少變鳴化聚合酶付鏈式反貨應及限講制性片李段長度跳多態(tài)性悶技術(雜PCR枯-RF令LP)限制性內(nèi)攜切核酸酶托的作用它們能夕識別D者NA的月特異序接列，并伶在識別最序列內(nèi)及或其旁燙切割雙仁鏈DN罵A。如神：Nde拿I限制酶凍的識別瘦序列和鑒切割位象點：CATAT臣G--砌-薄GTA費TA萄C--餃-Nla牌Ill限制酶的泉識別序列盈和切割位跳點：腥CAT挽GN彩NN-封--G饞TAC濃NNN-菌--PCR哥-RF盤LP檢喬測HBV挑YM輕DD變異PCR錯配引物陶設計PCR-味RFLP盲檢測HBV轉YM潛DD變異PCR預-RF吼LP檢衛(wèi)測HBV互YM雁DD變異PCR-普RFLP遷技術的評爛價優(yōu)點：簡單、廣帝泛易開展懶。缺點：1.限制裂性內(nèi)切酶痰種類有限沫。2.錯配哨引物將導蠢致退火溫撤度降低、巾非特異條全帶增多。3.引吸物非完幟全匹配秀，可能桑導致擴黃增效率巷降低、雜檢測敏感的夾下降。反向雜蛇交分析坐技術（蝦INN詳O—L河iPA射）INN弱O—L眉iPA仗診斷H凝BV尺YMD朗D變異DNA咱芯片技卵術BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hy蘭bri剖diz怠e”arrayerMicr病oarr順ayf娃abri口cati繁onSam扁ple主pr哨epa甘rat雙ionMole物cula該rhy咐brid浩izat穿ionDet定ect啞ion奸an理d倘ana罰lys胸isDNA蟲芯片技堅術診斷手HBV怨YM診DD變激異Dete蔽ctio雨nof剝YMD螺DMo諒tif畏Muta拳nts惑byO牲ligo跑nucl鑰eoti番deC研hips裕in薦Lam續(xù)ivud疤ine-簽Untr粱eate脆dPa懶tien刻tsw農(nóng)ith最Chro專nic棕Hepa牛titi皮sB壞Viru魚sIn反fect胖ion。JK爽ore爭an餐Med傭Sc架i2鴨004襯;1離9:訊541皮-54寸6.DNA攀芯片技綢術優(yōu)點辮局限性大通量耽技術和檔設備的要錦求高快速沸檢考測成本破高靈敏度蓬高可平行檢轉測實時熒許光定量搶PCR森在基因密變異中僅的應用探針定點禽突變PC舉R技術-督杰Taqm遼an-M喚GB探針引物末踢端堿基浸定點突岡變擴增摧技術高分辨熔舅解曲線法Taq襖man亭-MG惡B探針居定點突饞變PC韻R技術Taqm睡an-M草GB探針祖技術檢測YM酒DD變異HBV乒DN卡A>1蘆05cop倍ies過/mlW:M央=1:坑1HBV腸DNA>即105copi憐es/m凝lW:M=嗽10:1HBV怨DN才A<1詢05cop巖ies臂/mlW:M=蹄10:1：W：M探針定點青突變PC悠R技術優(yōu)點輝不民足靈敏度居高需要相愿對較貴游的熒光躍PCR為儀特異性舉好需要多條救熒光探針益，成本高費時短影響因素早多，存在糞一定誤判引物末溉端堿基獄定點突盯變擴增樂技術引物末端拌堿基定點皆突變擴增蝴技術

檢倉測YMD兆D變異熔解曲突線法檢福測YM男DD變普異特異性謝探針，驅其Tm溉值不同溶解曲掏線分析基質輔教助激光挽解吸電秒離飛行薪時間質煩譜(M撓ALD饅I-T兆OF史MS)會原理MAL武DI-斥TOF拼MS五檢測鬼HBV抓YM錫DD變闊異的原冷理酶切分子簡量.JP樂G基質輔助渡激光解吸鹿電離飛行星時間質譜構(MAL盤DI-缸TOF敗MS)優(yōu)點：高靈敏煮度、準勵確度、割分辨率能發(fā)現(xiàn)憲相對比浸例小于巷1%的它變異株陸。局限性美：設備昂貴蛾，目前國真內(nèi)難以用已于臨床檢共測。HBV耐機藥不同檢妹測技術的框比較Adv獵anc赴es闊in遮Mol壁ecu佛lar規(guī)Di植agn噸osi繁so注fH新BV僑Inf蒙ect捕ion柱an愿dD消rug柿Re稀sis勉tan袋ce。Int.蓮J.組Med.窮Sci存.2005腎2(1醉)：8-擺161Sen假siti咸vity架her想ere染fers西to磚the辨lowe嘩stl醉evel飄(%)吧at蔥whic賊han哀ass貫ayc準and屯etec猾tmi辜xtur揀eso框fmu皆tant巾and鄭wil型d-ty惱pev械irus擱.2I銷nfor蛛mati遇onc加onte累nti襪sco懶nsid顛ered嗚as屬ame小asur惜eof述at滑est’漆sab連ilit呆yto字pro毒vide屋bro型ad,胸rele蒸vant州inf封orma產(chǎn)tion森abo抖utp紡ossi陷ble處new晉muta藝tion肯s.3俱Upda趨teab餅ilit可yas耀sess膚est約hee嬸ase恰atw巷hich蛛at駛est副can等be橡dapt旗edt爐oin勾corp杯orat腐eth豆ede明tect三ion知ofa學new意mut鏟atio今n.n栽a,n陰ota獄ppli厲cabl餅e.n糕d,n滑otd埋eter脾mine斬d.HBV羽表型耐疊藥檢測有兩種斷途徑：1.細鑼胞外H棟BV聚粥合酶活庭性分析套。2.細筋胞藥物舊敏感性存實驗。細胞外悲HBV港聚合酶詢活性分間析目前常用乖的研究H看BV聚合莫酶活性模融型是將H此BV基因輸組插入桿遵狀病毒載喊體，繼而么轉染昆蟲賄細胞而表泛達HBV序顆粒，應嗽用親和層油析法純化陪HBV顆悅粒后，在斷細胞外評校價藥物對蛾聚合酶活偶性的影響荷。細胞外H樂BV聚合銳酶活性分輸析細胞藥物蝕敏感性實介驗該方法窮類似于慨細菌藥槳物敏感曲試驗。桶目前多養(yǎng)采用病葵毒載體遞將含有幅被檢測匯的含H稅BV變顫異位點領的全基溫因組導忍入肝細上胞源性戚細胞株召，然后煮將各種擠濃度的萍核苷類疼藥物加釀入培養(yǎng)姑液，經(jīng)沉過一定乏時間培苦養(yǎng)后檢堆測細胞糾上清中悼的HB牽VD宏NA含勞量。細胞藥圣物敏感倡性實驗細胞藥物候敏感性實戲驗該技術罩在操作堂上非常厚繁瑣，濤目前僅晝限于研蝕究之需報，主要蒜用于藥渾物開發(fā)繭研究，染尚不能血用于常硬規(guī)臨床施分析。臨床耐盆藥監(jiān)測YMD舒D變異齊前后病涌毒載量奮和AL兼T的變極化HBV桿MDD變?nèi)Ξ惻c病毒肝學突破判斷臨床輕耐藥時的狐建議1.結粘合核苷類貍藥物的應漂用史、起翅始病毒載巾量、是否裙合并其他參肝病等。2.注意坦甄別依從躍性不良。3.結褲合基因屯變異位距點。三、需橋要重視瞞的幾個萄問題慎重對待猜天然耐藥閥的結論。不要過曉分依基貌因型耐扯藥檢測協(xié)技術。正確對待緣瑞基因分型充技術。YMD首D自然者變異的歪幾組數(shù)薄據(jù)Akar路suM勝等采用I慣nnoL國ipa泰法檢測7最1例未經(jīng)勁抗病毒的旦成年慢性暗乙肝攜帶乓者，結果晨有13例款檢測到Y請MDD變喬異株。Lee伯CZ蔑等采用蛛引物末蒸端堿基煎定點突毒變擴增謀技術對煩28例威拉米夫財定治療米前的C豬HB患嶄者血清倆進行了化YMD兵D變異夕毒株檢走測，發(fā)腹現(xiàn)有1舊6例（文57.蒙1%）萍存在Y惹MDD片自然變藍異毒株差。日本K賭oba婦yas劉hi等蓮檢測1構8例無栗癥狀H束BV攜素帶者,被發(fā)現(xiàn)5社例YM娘DD變?nèi)萎?占形27.之78%銀。本實驗赤室關于閥YMD松D自然譯變異餓的2組葛數(shù)據(jù)196例居CHB患絕者中，檢裙出存在Y跳MDD變久異毒株者旅共21例名，檢出率線為10.某7%。其倍中YVD爽D陽性2兵0例，Y鄙IDD陽召性1例，規(guī)YVDD茂和YID下D同時陽本性者0例抱。183亞