蛋白質(zhì)的提取

蛋白質(zhì)的提取第1頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)分離和純化蛋白質(zhì)的分離步驟蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)純度等的測定第2頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)存在于生物體的組織細(xì)胞中，不同的生物體組織細(xì)胞所含的蛋白質(zhì)種類、數(shù)量也不盡相同。一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)第3頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳。1、蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象第4頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。2、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)第5頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。3、蛋白質(zhì)的沉淀作用第6頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等?？赡娉恋淼?頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。不可逆沉淀第8頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。4、蛋白質(zhì)的變性第9頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的變性變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。第10頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強的吸收。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。5、蛋白質(zhì)的紫外吸收第11頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四要研究某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，就必須將這種蛋白質(zhì)從組織細(xì)胞中分離、純化出來。因此，蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)便成為蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。二、蛋白質(zhì)分離和純化第12頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞；(2)隨時測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白質(zhì)含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進(jìn)行。第13頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四(1)生物組織的機械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用有機溶劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)提純：可用層析法、電泳法等進(jìn)行提純。(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。1．蛋白質(zhì)的分離步驟第14頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四血紅蛋白提取和分離步驟具體操作步驟（一）（二）（三）（四）第15頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（）90％血液組成成分第16頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四1.洗滌紅細(xì)胞1.1洗滌的目的：洗去血液中血漿及血小板等中的雜蛋白1.2洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水緩慢攪拌10min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有防止破壞紅細(xì)胞，使血紅蛋白流失（一）樣品處理黃色第17頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四2.血紅蛋白的釋放原理：紅細(xì)胞滲透作用吸水漲破，釋放血紅蛋白第18頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四3.分離血紅蛋白溶液分離過程：紅細(xì)胞混合液離心管甲苯層脂類物質(zhì)血紅蛋白層破碎物沉淀層高速離心10min濾紙過濾脂類物質(zhì)沉淀物燒杯分液漏斗第19頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四20mmol/L磷酸緩沖液透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)（二）粗分離——透析血紅蛋白第20頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四★注意事項★（1）生理鹽水作用？（3）兩次離心的差異？（4）透析袋的作用機理？模擬紅細(xì)胞生存環(huán)境，保持紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。破碎紅細(xì)胞；溶解細(xì)胞膜釋放血紅蛋白。前慢后快，前短后長。滲透作用（2）蒸餾水和甲苯的作用？第21頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四離心沉降法凝膠色譜法萃取法層析法電泳法（三）純化第22頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四1.凝膠色譜法

（1）原理：（2）材料：凝膠大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。凝膠是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內(nèi)部有許多貫穿的通道.根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法概念：凝膠色譜法純化蛋白質(zhì)第23頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

第24頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四第25頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程（四）純度鑒定—電泳第26頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四2）電泳結(jié)果分析如果出現(xiàn)一個條帶：樣品中含有一個分子質(zhì)量級別多肽；

如果出現(xiàn)兩個條帶：樣品中含有兩個分子質(zhì)量級別多肽。

第27頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等3）緩沖溶液－－洗脫劑

作用：

配制：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。

思考：如何配制不同PH值不同的緩沖液？第28頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四實驗四血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳【目的要求】1、掌握電泳技術(shù)的一般原理和基本操作過程。2、熟悉血清中蛋白分類以及電泳分離操作。第29頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四【實驗原理】

1.電泳：是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，它們的電泳遷移率不同。第30頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四V=EQ/(6πrη)M=V/E=Q/(6πrη)V：電泳速度M：遷移率E：電場強度Q：顆粒帶電荷量r：球形分子半徑η：介質(zhì)粘度第31頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四【實驗原理】

2.影響電泳的因素：

內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀

外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象第32頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素

決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√第33頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四3.醋酸纖維素溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120μm，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點第34頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四血清蛋白參考值等電點分子量（kDa）占總蛋白的百分?jǐn)?shù)(%)清蛋白4.646961~71α1球蛋白5.062003~4α2球蛋白5.063006~10β球蛋白5.1290~1507~11γ球蛋白6.85156~9509~18第35頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四4.經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)的百分含量。第36頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四【實驗器材】1.DYY-6C型

雙穩(wěn)定時電泳儀和DYY-Ⅲ型電泳槽2.醋酸纖維薄膜（2cm×8cm）：1片/人。3.培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.點樣器：載玻片。5.濾紙：公用。6.鑷子：一個/組。第37頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四【實驗試劑】1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液第38頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四1.浸泡將2×8cm醋酸纖維薄膜置于電泳緩沖液中，浸泡15min左右，至完全浸透，方可用于點樣?！緦嶒灢僮鳌康?9頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四

2.點樣用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，迎光判斷光面與無光澤面。用邊緣整齊的玻片沾取少量無溶血血清，垂直按壓于醋纖膜標(biāo)號一端約1.5-2㎝處(約2～3μl)第40頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四3.電泳將點樣端的薄膜平貼在陰極濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極濾紙橋上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。平衡片刻(2-3min)；使其自然充滿緩沖液；而后電壓120V，電流0.4～0.6mA/㎝，通電45分鐘。

第41頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四4.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡3-5min第42頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四5.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次(3-4次)，直至條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。第43頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四6.記錄和分析實驗結(jié)果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進(jìn)行描述、記錄在預(yù)習(xí)本上，并判斷分析其結(jié)果。第44頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四【注意事項】1、點樣前，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。2、薄膜的浸潤與選擇正確膜面是電泳成敗的關(guān)鍵之一。3、點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。4.手盡量不要觸及薄膜，用鑷子夾取。5、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。垂直點樣。6、電泳時應(yīng)將薄膜的點樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點樣面向下。7、電泳開始后，不能再取放薄膜，以防觸電。如必需進(jìn)行，要先關(guān)閉電源。8、應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進(jìn)行復(fù)染。第45頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四【思考題】電泳圖譜清晰的關(guān)鍵是什么？如何正確操作？第46頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四本堂小結(jié)本節(jié)內(nèi)容目標(biāo)：血紅蛋白的分離和純化獲取紅細(xì)胞（離心）破碎紅細(xì)胞，釋放血紅蛋白從各紅細(xì)胞的成分中獲取血紅蛋白（離心）初步純化血紅蛋白（透析）第47頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四從生物材料中提取某些特定成分第48頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四背景知識早在古代，人類就已發(fā)現(xiàn)芳香氣味的植株或花卉能使人神清氣爽，將這些植物制成干品后，可當(dāng)做藥物和香料使用。但是，植物香料易揮發(fā)，不易儲存。歐洲中世紀(jì)香料貿(mào)易的發(fā)展，促成了植物芳香油提取技術(shù)的誕生。第49頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四

16世紀(jì)，制備植物芳香油的技術(shù)已相當(dāng)成熟。19世紀(jì)，有機化學(xué)迅速發(fā)展，人們通過分析植物芳香油的化學(xué)成分，找到了芳香的根源，進(jìn)而合成了人造香料。如今，植物芳香油廣泛地應(yīng)用于輕工、化妝品、飲料和食品制造的方面。第50頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四基礎(chǔ)知識動物：植物：微生物：主要來源于麝、靈貓、海貍和抹香鯨等天然香料的來源根、莖、葉、花、果實、種子真菌第51頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四植物芳香油的物理性質(zhì):植物芳香油的化學(xué)本質(zhì):具有很強的揮發(fā)性主要包括萜類化合物及其衍生物第52頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四植物芳香油的提取方法：植物芳香油選擇方法的依據(jù)：根據(jù)植物原料的特點來決定蒸餾、壓榨、萃取第53頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四提取植物芳香油的常用方法：提取植物芳香油常用方法的原理：水蒸氣蒸餾法：水中蒸餾法、水上蒸餾法、水氣蒸餾法利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，冷卻后，油水混合物又重新分出油層和水層第54頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四水中蒸餾適于某些鮮花、破碎果皮和不易粘結(jié)的原料。但水中蒸餾精油中的酯類成分易水解，所以含酯類高的香料植物不能采用這種方法。1.水中蒸餾第55頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四又稱隔水蒸餾，是把原料置于蒸餾鍋內(nèi)的篩板上，篩板下盛放一定水量以滿足蒸餾操作所需的足夠的飽和蒸汽，水層高度以水沸騰時不濺濕原料底層為原則。2.水上蒸餾第56頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四水上蒸餾應(yīng)用較廣，大面積種植的芳香植物為薄荷、香茅、桉樹葉等都用水上蒸餾提取精油；此法也適用于粉碎后的干燥原料包括某些干花。第57頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四是由外來的鍋爐蒸汽直接進(jìn)行蒸餾。通常在篩板下鍋底部位裝有一條開小孔的環(huán)形管，鍋爐來的蒸汽通過小孔直接噴出。通過篩板的篩孔進(jìn)入原料層加熱原料。由鍋爐來的蒸汽是具有一定蒸汽壓力，溫度較高而含濕量又較低的飽和蒸汽，能很快加熱料層，因此，對干料加熱蒸餾時，干料必須在裝鍋前預(yù)先濕透。直接蒸汽蒸餾，其蒸餾速度快，溫度高，可縮短蒸餾時間，高沸點的成分可蒸出，出油率高。3.直接蒸汽蒸餾第58頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四

因為水中蒸餾會導(dǎo)致原料焦糊和有效成分水解等問題原因：提取柑橘芳香油的方法：通常用壓榨法第59頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四萃取法的原理：將粉碎、干燥的植物原料用有機溶劑浸泡，使芳香油溶解在有機溶劑中的方法。芳香油溶解于有機溶劑后，只需蒸發(fā)出有機溶劑，就可以獲得純凈的植物芳香油了。第60頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四比較項目實驗原理方法步驟適用范圍水蒸氣蒸餾法萃取法壓榨法利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來使芳香油溶解在有機溶劑中，蒸發(fā)后得到芳香油通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油①水蒸汽蒸餾②分離油層③除水過濾①粉碎、干燥②萃取、過濾③濃縮①石灰水浸泡、漂洗②壓榨過濾靜置③再次過濾提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性強的芳香油原料顆粒盡可能細(xì)小，能充分浸泡在有機溶劑中適用于柑橘、檸檬等易焦糊原料的提取植物芳香油提取三種方法的比較第61頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四1、提取方法：水蒸氣蒸餾法一、玫瑰精油的提?。簩嶒炘O(shè)計2、實驗設(shè)計玫瑰精油的提取裝置：第62頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四3、實驗步驟：

①采集玫瑰花：采集盛花期（5月上中旬）的玫瑰花，清水清洗瀝干。

②裝入蒸餾原料：稱取50g玫瑰花放入蒸餾瓶，添加200mL蒸餾水。③安裝蒸餾裝置：所有儀器必須事先干燥，保證無水。④加熱蒸餾第63頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四⑤拆卸蒸餾裝置：

⑥分離油層：

蒸餾完畢，應(yīng)先撤出熱源，然后停止通水，最后拆卸蒸餾裝置，拆卸的順序與安裝時相反。

收集錐形瓶中的乳濁液，向錐形瓶中加入質(zhì)量濃度為0.1g／mL的NaCl，然后將其倒入分液漏斗中，用分液漏斗將油層和水完全分開。放出玫瑰精油，用接收瓶收集。⑦除去水分：

向接收瓶加入無水Na2S04，24h后過濾，得到玫瑰油。注意事項：蒸餾時間不能過短，溫度不能過高。第64頁，共71頁，2023年，2月20日，星期四鮮玫瑰花+清水水蒸氣蒸餾油水混合物油水分離除水玫瑰油加無水Na2SO4加NaCl氯化鈉：促使油水