PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量

PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量第1頁(yè)/共10頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釹DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，并學(xué)會(huì)用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。第2頁(yè)/共10頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開(kāi)，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計(jì)的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對(duì)分子質(zhì)量。

SDS是十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate）的簡(jiǎn)稱，它是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，就可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)對(duì)遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點(diǎn)一致，便于比較。第3頁(yè)/共10頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)器材直流穩(wěn)壓電泳儀垂直平板電泳槽（含玻璃板、夾條、梳齒、夾子等）移液器（1.0ml、200μl、20μl）微量注射器（20μl）燒杯、培養(yǎng)皿、試管、滴管、直尺脫色搖床第4頁(yè)/共10頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)試劑1.凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色試劑瓶4℃保存，30天內(nèi)使用。2.分離膠緩沖液：1.5mol/LTris-HCl，pH8.8。

18.15Tris（三羥甲基氨基甲烷），少許重蒸水溶解，用1MHCl調(diào)pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。3.濃縮膠緩沖液：0.5mol/LHCl，pH6.8。6gTris,少許重蒸水溶解，用1MHCl調(diào)pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。4.10%SDS，室溫保存。5.兩類樣品緩沖液：

2倍還原緩沖液（2×reducingbuffer）

0.5mol/LHCl，pH6.82.5ml

甘油2.0ml

質(zhì)量濃度10%SDS4.0ml

質(zhì)量濃度0.1%溴酚藍(lán)0.5ml β-巰基乙醇1.0ml

總體積10ml第5頁(yè)/共10頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)試劑6.電極緩沖液，pH8.3。

Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。7.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（上海產(chǎn)）。開(kāi)封后溶于200μl重蒸水，加200μl2倍樣品緩沖液（還原緩沖液），分裝20小管，-20℃保存。臨用前沸水浴3～5min，其相對(duì)分子量（Mr）如下：兔磷酸化酶B97400

牛血清白蛋白66200

兔肌動(dòng)蛋白43000

牛碳酸酐酶31000

胰蛋白酶抑制劑20100

雞蛋清溶菌酶144008.質(zhì)量濃度為10%過(guò)硫酸銨：（臨用前配制）9.染色液：

0.25g考馬斯亮藍(lán)R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸餾水定容至100ml，過(guò)濾。10.脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875ml重蒸水混合。11.待測(cè)蛋白樣品。12.1%瓊脂糖（最好用電極液配）13.TEMED

第6頁(yè)/共10頁(yè)五、實(shí)驗(yàn)步驟1、洗凈晾干電泳槽、玻璃板、夾條、梳齒等。安裝后用1%瓊脂糖封玻璃板兩側(cè)及底部。2、分離膠的選擇和配置方法

1）按照待分離蛋白質(zhì)的大致分子量選用不同濃度的膠。

2）分離膠和濃縮膠的配制方法第7頁(yè)/共10頁(yè)五、實(shí)驗(yàn)步驟3、分離膠的灌制按照上表左邊操作。因加入TEMED后凝膠就開(kāi)始聚合，故應(yīng)立即混勻混合液，然后用滴管吸取分離膠，在電泳槽的兩玻璃之間灌注，避免氣泡。留出梳齒的齒高加1cm空間以便灌注濃縮膠。用滴管小心地在溶液上覆蓋一層重蒸水，將電泳槽垂直靜置于室溫下約40～60min，待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的重蒸水。4、濃縮膠的灌制

（等分離膠聚合后配制）按照上表右邊操作。混勻后灌注在分離膠上。小心插入梳齒，避免混入氣泡，將電泳槽垂直靜置于室溫下至濃縮膠完全聚合（約40min）。5、樣品的制備

1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的制備（樣品約5-10μg，最好離心取上清加樣）取分裝好的20

μl低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，放入沸水浴中加熱3～5min，取出冷卻。

2）待測(cè)樣品的制備（同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品處理）6、電泳

1）待濃縮膠完全聚合后，標(biāo)記好加樣孔位置，將電泳槽注滿電極緩沖液，小心拔出梳齒，用電極緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。

2）用微量注射器按次序向加樣孔內(nèi)加樣。

3）接上電泳儀，上電極接電源負(fù)極，下極接正極。打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)電流至20～30mA并保持電流強(qiáng)度恒定。待藍(lán)色的溴酚藍(lán)條帶遷移至距凝膠下端約1cm時(shí)，停止電泳。

第8頁(yè)/共10頁(yè)五、實(shí)驗(yàn)步驟7、染色與脫色

小心將膠取出，置于一大培養(yǎng)皿中。加染色液染色30min，傾出染色液，加入脫色液，數(shù)小時(shí)更換一次脫色液，直至背景清晰。8、相對(duì)分子量的計(jì)算用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及溴酚藍(lán)前沿距分離膠頂端的距離，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率（R）：相對(duì)遷移率=樣品遷移距離（cm）