發(fā)酵工程發(fā)酵工業(yè)菌種

2發(fā)酵工業(yè)菌種思考題1、常見的工業(yè)微生物包括哪些類群？2、作為工業(yè)生產(chǎn)菌株應(yīng)具備哪些基本特性？3、了解發(fā)酵工業(yè)中的細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌及其生產(chǎn)的產(chǎn)品。4、掌握菌種分離篩選的基本過程。第一頁，共五十九頁。5、誘變育種及其原理。6、常用的化學(xué)誘變劑。7、菌種退化、原因與防治。8、菌種保藏的方法。第二頁，共五十九頁。常見的工業(yè)微生物：包括病毒、立克次氏體、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌、單細(xì)胞藻類、原生動物和支原體等。

廣義的微生物：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌及危害細(xì)菌、放線菌生長的噬菌體等。

第三頁，共五十九頁。一、工業(yè)微生物常用菌種1．細(xì)菌（bacteria）發(fā)酵工業(yè)常用的細(xì)菌有枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、乳酸菌、棒狀桿菌、短桿菌等。用于生產(chǎn)酶制劑、醋酸、乳酸、氨基酸、肌苷酸等。第四頁，共五十九頁。2．放線菌(actinomyces)1）鏈霉菌屬(Streptomyces)產(chǎn)生的抗生素：包括鏈霉素、新霉素、卡那霉素、妥布拉霉素、越霉素、春雷霉素、土霉素、金霉素、螺旋霉素、紅霉素、麥迪霉素等。2）其它放線菌產(chǎn)生的抗生素：慶大霉素、利福霉素、指孢囊霉素、馬杜拉霉素。

第五頁，共五十九頁。3．酵母(yeast)酵母是單細(xì)胞真核微生物,具有典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu),生長溫度范圍在4-30℃,最適溫度為25-30℃。酵母在自然界分布很廣，主要生長在偏酸性的含糖環(huán)境中。工業(yè)上常用的包括面包酵母、酒精酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、假絲酵母、絲赤酵母等。用于釀酒、制造面包、生產(chǎn)脂肪酶、單細(xì)胞蛋白等。第六頁，共五十九頁。4．霉菌(mould)是一群在營養(yǎng)基質(zhì)止形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲真菌的通稱。1）曲霉屬(Aspergillus)黑曲霉（A.niger）：有多種活性強(qiáng)大的酶系，是酶制劑工業(yè)廣泛應(yīng)用的菌種之一。用以生產(chǎn)酸性蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、纖維素酶等，它的變異菌株可產(chǎn)生檸檬酸、葡萄糖酸、草酸及抗壞血酸。第七頁，共五十九頁。2）青霉屬（Penicillium）

產(chǎn)黃青霉：是青霉素的最重要生產(chǎn)菌，并能產(chǎn)生葡萄糖氧化酶及葡萄糖酸、檸檬酸、抗壞血酸等。

展開青霉：主要用于生產(chǎn)抗真菌的抗生素－灰黃霉素。

第八頁，共五十九頁。3）根霉屬(Rhizopus)米根霉（Roryzae）：米根霉在我國酒藥和酒曲中常見。其淀粉酶活力相當(dāng)強(qiáng)，有淀粉糖化能力和轉(zhuǎn)化蔗糖的性能，還能產(chǎn)生脂肪酶。能發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸。華根霉：華根霉多出現(xiàn)在我國酒藥和酒曲中，具較強(qiáng)的耐高溫性能（45℃能生長），淀粉酶液化力強(qiáng)，有溶膠性，能產(chǎn)生酒精、芳香脂類、乳酸及反丁烯二酸，能轉(zhuǎn)化甾族化合物。第九頁，共五十九頁。4）紅曲霉屬(Monascus)菌絲呈紅色以至紫色，可由我國南方紅曲中分離得到。

第十頁，共五十九頁。5．其它擔(dān)子菌：香菇、靈芝等。藻類：螺旋藻、單胞藻等?；蚬こ叹夯蚬こ叹诎l(fā)酵工程已得到廣泛應(yīng)用，如酶制劑、胰島素、干擾素、生長激素、乙型肝炎病苗等的生產(chǎn)。

第十一頁，共五十九頁。（1）能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；（2）生長較快，發(fā)酵周期短；（3）培養(yǎng)條件易于控制；（4）抗噬菌體及雜菌污染的能力強(qiáng)；二、工業(yè)生產(chǎn)對菌種的要求第十二頁，共五十九頁。（5）菌種不易變異退化，以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定；（6）對放大設(shè)備的適應(yīng)性強(qiáng)；（7）菌種為非病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物物質(zhì)和毒素。第十三頁，共五十九頁。三、發(fā)酵工業(yè)菌種的分離與篩選

菌株分離（StrainSeparation)就是將混雜著各種微生物的樣品按照實(shí)際需要和菌株的特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效的方法對它們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需微生物的過程。分離微生物新種的具體過程大體可分為采樣、增殖、純化和性能測定。第十四頁，共五十九頁。第十五頁，共五十九頁。采樣原則：材料來源越廣泛，越有可能獲得新的菌種。在一些極端環(huán)境（高溫、高壓、高鹽等），可找到能適應(yīng)苛刻條件的微生物類群。了解目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)和可能產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的微生物種類及其生理特征，可提高效率，事半功倍。

1、樣品的采集第十六頁，共五十九頁。2、樣品的預(yù)處理目的：提高菌種分離效率。物理方法：熱處理（用于減少樣品中的細(xì)菌數(shù)）；膜過濾法和離心法（用于濃縮水中的微生物）；化學(xué)方法：通過在培養(yǎng)基中添加某些化學(xué)成分來增加特定微生物的數(shù)量。誘餌法：將一些物質(zhì)（如石蠟、花粉、毛發(fā)等）加到待分離的樣品中作誘餌富集目的菌。第十七頁，共五十九頁。3、富集培養(yǎng)通過富集培養(yǎng)增加待分離的目標(biāo)微生物的數(shù)量?？刂婆囵B(yǎng)基的營養(yǎng)成分：碳源或氮源；控制培養(yǎng)條件：溫度、pH、滲透壓、溶解氧濃度等。

第十八頁，共五十九頁。4、菌種分離平板劃線分離法稀釋分離法涂布分離法

第十九頁，共五十九頁。對菌株的篩選必須要有一個好的方法（最簡單的方法）來加以鑒定，如顏色的變化、抑菌圈、透明圈等。5、菌種的篩選

第二十頁，共五十九頁。四、發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定

1、經(jīng)典的分類鑒定方法形態(tài)學(xué)特征：生理生化特性：血清學(xué)試驗(yàn)與噬菌體分型：氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析：

第二十一頁，共五十九頁。2、現(xiàn)代分類鑒定方法DNA的堿基組成：核酸的分子雜交：遺傳重組特性分析：rRNA序列分析：細(xì)胞化學(xué)成分特征分類法：

第二十二頁，共五十九頁。五、發(fā)酵工業(yè)菌種改良菌種選育改良的目標(biāo)：提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量；提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物；改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程；改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品。第二十三頁，共五十九頁。自然選育、誘變育種、抗噬菌體菌種的選育、雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程、蛋白質(zhì)工程、代謝工程技術(shù)等都被用優(yōu)良生產(chǎn)菌種的選育。

第二十四頁，共五十九頁。菌株選育典型流程出發(fā)菌株（砂土管或冷凍管）小試原種特性考擦斜面或搖瓶培養(yǎng)24h培養(yǎng)基優(yōu)化單孢子懸液菌懸液挑出高產(chǎn)菌株誘變處理搖瓶復(fù)篩處理前后計數(shù)稀釋涂平板傳種斜面觀察單菌落形態(tài)挑選單菌落轉(zhuǎn)種斜面保藏菌株對照組比較搖瓶初篩挑出高產(chǎn)斜面

第二十五頁，共五十九頁。1、自然選育不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程稱為自然選育（spontaneousmutation）。

第二十六頁，共五十九頁。自然選育最為成功的例子是目前被廣泛使用的卡介苗(BCGvaccine)。法國的卡爾密脫(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的結(jié)核分枝桿菌接種在牛膽汁、甘油、馬鈴薯培養(yǎng)基上，連續(xù)傳代培養(yǎng)230代，前后經(jīng)歷13年時間，終于在1923年獲得顯著減毒的結(jié)核桿菌----卡介苗。

第二十七頁，共五十九頁。2、誘變育種誘變育種是利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率大幅度提高，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)研究用。第二十八頁，共五十九頁。物理誘變劑

物理誘變主要是采用輻射。如紫外線、X射線、γ射線、激光和快中子等都是常用的物理誘變劑。第二十九頁，共五十九頁?；瘜W(xué)誘變劑常用的化學(xué)誘變劑根據(jù)其作用方式不同分為三種類型。

(1)與核酸堿基化學(xué)反應(yīng)的誘變劑

此類型主要有烷化劑、亞硝酸和羥胺等。第三十頁，共五十九頁。常見的烷化劑有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、亞硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。

堿基中的鳥嘌呤最易受烷化劑作用，形成6-烷基鳥嘌呤，并與胸腺嘧啶錯誤配對，造成堿基轉(zhuǎn)換。胸腺嘧啶被烷基化后，可與鳥嘌呤錯誤配對。第三十一頁，共五十九頁。

(2)堿基類似物

這些化合物有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5-FU)、8氮鳥嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP)等。它們與堿基的結(jié)構(gòu)類似，在DNA復(fù)制時，它們可以被錯誤地?fù)饺隓NA，引起誘變效應(yīng)，所以說它們引起堿基置換的作用是間接的。第三十二頁，共五十九頁。

(3)移碼突變的誘變劑

移碼突變是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的一類突變。由移碼突變產(chǎn)生的突變體稱為移碼突變體。

吖啶類染料(原黃素、吖啶黃、吖啶橙及α-氨基吖啶等)和一系列稱為ICR類的化合物(它們是一些由烷化劑與吖啶類化合物相結(jié)合的化合物)都是移碼突變的有效誘變劑。第三十三頁，共五十九頁。3

誘變育種方法1）出發(fā)菌株的選擇

自然界直接分離到的野生型菌株

經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株

已經(jīng)歷多次育種處理的菌株2）制備菌懸液3）誘變處理劑量確定預(yù)試驗(yàn)第三十四頁，共五十九頁。誘變育種中還常常采取誘變劑復(fù)合處理，使它們產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。復(fù)合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時使用，也可用同一誘變劑重復(fù)使用。因?yàn)槊糠N誘變劑有各自的作用方式，引起的變異有局限性，復(fù)合處理則可擴(kuò)大突變的位點(diǎn)范圍，使獲得正突變菌株的可能性增大，因此，誘變劑復(fù)合處理的效果往往好于單獨(dú)處理。第三十五頁，共五十九頁。誘變劑復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)菌種單獨(dú)處理復(fù)合處理誘變劑突變率(%)誘變劑突變率(%)土曲霉紫外線X射線21.319.7紫外線+X射線42.8土曲霉氮芥(0.1%)紫外線不明顯4.7紫外線+氮芥11.0鏈霉菌紫外線γ射線31.035.0紫外線+γ射線43.6金色鏈霉菌(2U-84)二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外線6.061.7812.5紫外線+二乙烯三胺紫外線+硫酸二乙酯26.635.86灰色鏈霉菌(JIC-1)紫外線9.8紫外線+可見光照射1次紫外線+可見光照射6次9.716.6第三十六頁，共五十九頁。4、雜交育種

雜交育種(Hybridization)一般是指人為利用真核微生物的有性生殖或準(zhǔn)性生殖，或原核微生物的接合、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等過程，促使兩個具不同遺傳性狀的菌株發(fā)生基因重組，以獲得性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。第三十七頁，共五十九頁。5、原生質(zhì)體融合技術(shù)第三十八頁，共五十九頁。6、基因工程育種第三十九頁，共五十九頁。7、蛋白質(zhì)工程育種定點(diǎn)突變技術(shù)定向進(jìn)化技術(shù)8、代謝工程育種9、反向生物工程育種

第四十頁，共五十九頁。六、發(fā)酵工業(yè)菌種的復(fù)壯與保藏

（一）工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因菌種退化（degeneration）主要指生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的優(yōu)良菌株，由于連續(xù)傳代或保藏之后，群體中某些生理和形態(tài)特征逐漸退化或完全喪失（包括菌株產(chǎn)孢子能力、發(fā)酵主產(chǎn)物產(chǎn)量下降）的現(xiàn)象。第四十一頁，共五十九頁。1、退化的表現(xiàn)菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變：如蘇云金芽孢桿菌的芽孢和伴孢晶體變得小而少；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少：如細(xì)黃鏈霉菌的菌苔變薄、生長緩慢，不再產(chǎn)生典型而豐富的橘紅色分生孢子層；第四十二頁，共五十九頁?？共涣辑h(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫等）能力的減弱。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降：如藤倉赤霉產(chǎn)赤霉素能力下降；第四十三頁，共五十九頁。2、退化的原因

1）基因突變那些控制生產(chǎn)性狀的基因發(fā)生負(fù)突變。

2）分離現(xiàn)象由于誘變獲得的高產(chǎn)菌株本身不純，高產(chǎn)突變只發(fā)生在一個核（多核時）和一條DNA鏈上（單核時），隨著細(xì)胞分裂，核發(fā)生分離，突變基因和未突變基因發(fā)生分離，出現(xiàn)了突變的高產(chǎn)菌株和未突變的低產(chǎn)菌株。第四十四頁，共五十九頁。3）自發(fā)突變培養(yǎng)環(huán)境營養(yǎng)不良、發(fā)酵時間過長而積累有害產(chǎn)物都會加快菌種退化。第四十五頁，共五十九頁。3、菌種退化的防治

1）從菌種選育方面考慮在育種過程中，應(yīng)盡可能使用孢子或單核菌株，避免對多核細(xì)胞進(jìn)行處理；在使單鏈突變的同時，使另一條單鏈喪失模板作用，以減少出現(xiàn)分離回復(fù)現(xiàn)象；誘變處理后應(yīng)進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌株的“純度”。

第四十六頁，共五十九頁。2）控制傳代次數(shù)如產(chǎn)腺苷的芽孢桿菌黃嘌呤營養(yǎng)缺陷型菌株，回復(fù)子的比例隨傳代次數(shù)的增加而增加，腺苷產(chǎn)量也隨之下降。

3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件在進(jìn)行棲土曲霉培養(yǎng)時，溫度從28-30℃提高到33-34℃，可防止產(chǎn)孢子能力的衰退。

第四十七頁，共五十九頁。4）利用不易衰退的細(xì)胞傳代在放線菌和霉菌中，由于其菌絲細(xì)胞常含有幾個細(xì)胞核，若用菌絲接種就易出現(xiàn)衰退，而孢子一般是單核的，用于接種，就不會發(fā)生這類現(xiàn)象。有些霉菌如用其分生孢子傳代易于衰退，而改用其子囊孢子接種，則能避免退化。

5）采用有效的菌種保藏方法

第四十八頁，共五十九頁。1、純種分離法在衰退菌種的細(xì)胞群中，一般還存在仍保持原有性狀的個體，設(shè)法對其進(jìn)行分離純化。

（二）、工業(yè)生產(chǎn)菌種的復(fù)壯

2、淘汰已衰退的個體采用高溫或低溫及其方法淘汰衰退的個體。第四十九頁，共五十九頁。3、選擇合適的培養(yǎng)條件

如平菇菌種在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代會導(dǎo)致菌種衰退，而在PDA綜合培養(yǎng)基（PDA中添加維生素和蛋白胨等）中培養(yǎng)則能使衰退的菌種復(fù)壯。

第五十頁，共五十九頁。（三）工業(yè)生產(chǎn)菌種的保藏

菌種保藏的意義：保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，滿足生產(chǎn)需要。菌種保藏的基本原理：根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。一般可通過降低培養(yǎng)營養(yǎng)成分、低溫、干燥和缺氧等方法，達(dá)到防止突變、保持純種的目的。第五十一頁，共五十九頁。2．穿刺保藏法：常用于保藏各種需氣性細(xì)菌。1．斜面保藏法這是一種最基本的方法，適用范圍廣，細(xì)菌、真菌和放線菌都可應(yīng)用。3．沙土管干燥保藏法：這種方法適用于形成芽孢的細(xì)菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌。其原理是將微生物吸附在各種載體上，干燥后保藏。

第五十二頁，共五十九頁。4．冷凍干燥保藏法：其基本原理是將微生物或孢子冷凍，然后在減壓的情況下使水分升華，使細(xì)胞的代謝、生理等生命活動處在停止?fàn)顟B(tài)下長期保藏。

第五十三頁，共五十九頁。5．液氮保藏法：其方法是將濃的懸液加入滅菌后的分散劑中，細(xì)菌加入最終濃度為10%的甘油或5%二甲基亞砜（DMSO）作為防凍的保護(hù)劑。

6．低溫保藏法：大多數(shù)微生物可在-20℃以下的低溫中保藏。使用密封性能好的螺旋口小管，加入1—2ml的菌液，直接放入低溫冰箱中保藏。

第五十四頁，共五十九頁。（四）、國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)

1、我國的主要微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)1）普通微生物菌種保藏管理中心中國科學(xué)院微生物研究