經(jīng)典單克隆抗體技術(shù)

經(jīng)典單克隆抗體技術(shù)第1頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四講授提綱多克隆抗體的概念單克隆抗體的概念單克隆抗體的制備單克隆抗體的應(yīng)用第2頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四1975年英國科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。每個B淋巴細(xì)胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無限增殖，因此雜交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。第3頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四多克隆抗體(Polyclonalantibody)

給動物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱為多克隆抗體?？乖瓫Q定簇：是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，又稱表位(epitope)。第4頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體第5頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）

通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。細(xì)胞克?。河梢粋€細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集團。第6頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。第7頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四雜交瘤技術(shù)

通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞和建系小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以獲得同時具有抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性特征的雜交瘤細(xì)胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。第8頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四單克隆抗體制備原理用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基對融合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和篩選。HAT選擇性培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加次黃嘌呤HyPoxanthineH，氨基喋呤AminoopterinA及胸腺嘧啶核苷ThymidineT。第9頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四單克隆抗體制備原理

-----第10頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四HAT培養(yǎng)基的選擇原理⑴氨甲蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，細(xì)胞在含有氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA。⑵瘤細(xì)胞是HGPRT酶陰性細(xì)胞，自身不能通過替代途徑合成DNA而繁殖。⑶B細(xì)胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養(yǎng)存活（只存活5~7d，且功能下降)。⑷融合細(xì)胞含有B細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中瘤細(xì)胞核利用B細(xì)胞的HGPRT酶進(jìn)行旁路合成DNA而存活。第11頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四

在HAT選擇性培養(yǎng)基中，由于變異的瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細(xì)胞不可避免也要死亡。融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被篩選出來。第12頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四HAT選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（denovosynthesis）核苷酸補救合成途徑（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）第13頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四單克隆抗體雜交瘤技術(shù)基本流程

第14頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四單克隆抗體的制備步驟

1.免疫原的制備

顆粒性抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì)。

可溶性抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于5000Da物質(zhì)。

可溶性抗原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成顆粒性抗原才能刺激動物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價的抗體。第16頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四

2.免疫動物

可溶性抗原（蛋白質(zhì)）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，10天后，斷尾取血一滴，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗。一個月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。顆粒性抗原如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。第17頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四為什么要反復(fù)注射抗原？？

正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機會，必須加強免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。

第18頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四3.骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞株處于良好的生長狀態(tài)，本身不能分泌任何抗體或免疫球蛋白；瘤細(xì)胞的來源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者組織相容性抗原一致；細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)或TK缺陷狀態(tài)。第19頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四4.細(xì)胞融合

取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞按5-10：1的比例，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50%PEG作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。第20頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長繁殖，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feedercell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長繁殖成群體，因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。第21頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四

許多種類的動物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。第22頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞融合方式物理融合法：電融合、激光融合化學(xué)融合法：PEG融合生物融合法：仙臺病毒第23頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞離心1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液10ml離心1000rpm7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)第24頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四5.雜交瘤細(xì)胞及陽性孔的篩選細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HAT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲50多個對上述抗原有反應(yīng)的陽性孔。

第25頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四6.陽性孔的特異性檢測及特異性陽性孔的克隆

經(jīng)過抗體測定的陽性孔，可以擴大培養(yǎng)，進(jìn)行克隆，以得到單個細(xì)胞的后代分泌單克隆抗體。

克隆化的方法很多，包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。第26頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四陽性孔的檢測第27頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第28頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四7.單克隆抗體的制取制取方式：體外——培養(yǎng)罐法體內(nèi)——腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定——Ig類型、親和力、效價、特異性決定簇鑒定——是否針對同一決定簇第29頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四體內(nèi)——腹腔接種

克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的100~1000倍。第30頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四雜交瘤細(xì)胞的凍存

當(dāng)獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后，必須將一部分雜交瘤細(xì)胞保存，否則在連續(xù)傳代的過程中，可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產(chǎn)生抗體的特性。另外在長期的培養(yǎng)過程中，難免不發(fā)生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。第31頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四雜交瘤細(xì)胞通常用含有8％--10%的二甲亞砜和20％小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個月短期保存。凍存細(xì)胞需要緩慢降溫，復(fù)蘇細(xì)胞時需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。第32頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四單克隆抗體的特性①單一特異性，與一個抗原決定簇反應(yīng)；②可重復(fù)性，能夠提供完全一樣的抗體制劑；③一經(jīng)制出，可無限量地供應(yīng)；④生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。第33頁，共36頁，2023年，2月20日，星期四多抗與單抗制劑的比較多抗單抗單抗（血清）（腹水）（培養(yǎng)上清）特異性抗體含量（mg/ml）0.1-10.5-50.005-0.025無關(guān)Ig含量（mg/ml）100.5-1—其他血清蛋白大量極少—均一性—++特異性多決定簇單決定簇單決定簇穩(wěn)定性較好略差略差重復(fù)性差