食品有害微生物檢測(cè)與控制大腸桿菌

食品有害微生物檢測(cè)與控制大腸桿菌第1頁(yè)/共38頁(yè)大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義作為糞便污染食品的指標(biāo)菌，MPN值愈低則說(shuō)明食品受糞便污染程度及對(duì)人體健康危害程度愈低作為腸道致病菌污染食品的指針，大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關(guān)系要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)1982年美國(guó)食物中毒；我國(guó)：1997年在一定范圍內(nèi)開(kāi)展監(jiān)測(cè)，已陸續(xù)有十余個(gè)省份在市售食品、進(jìn)口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌，并在1999年我國(guó)蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7，第2頁(yè)/共38頁(yè)GB4789.3-2010大腸菌群測(cè)定定義：Coliforms，一群在36℃培養(yǎng)48h可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源自人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)第3頁(yè)/共38頁(yè)ETEC

EIEC

陰溝腸桿菌EHEC

大腸菌群耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157：H7大腸桿菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)普遍存在的細(xì)菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時(shí)，可引起感染。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語(yǔ)，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。一般認(rèn)為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。

總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時(shí)能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。耐熱大腸菌群即糞大腸菌群，作為一種衛(wèi)生指標(biāo)菌，耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物，因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染，可能存在大腸桿菌。但是，耐熱大腸菌群的存在并不代表對(duì)人有什么直接的危害。致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細(xì)胞，具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）和腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)腸出血性大腸桿菌，感染性腹瀉是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系第4頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)概述生物學(xué)特性

1)形態(tài)與染色2)培養(yǎng)特性3)生化特性4）抵抗力

5）致病性1)形態(tài)與染色G－、有鞭毛、無(wú)芽孢或有莢膜，兩端鈍圓短桿菌。大小為(1.1－1.5)μmX(2.0－6.0)μm(活菌)或(0.4－0.7)μmX(1.0－3.0)μm

(染色菌)，絕大多數(shù)菌株有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，周身還有菌毛，無(wú)芽孢，某些菌株具有莢膜。

第5頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)概述2)培養(yǎng)特性在普通培養(yǎng)基上：長(zhǎng)成2－3mm的S型小菌落；在鮮血瓊脂平板上:生長(zhǎng)，有些菌株可見(jiàn)β型溶血環(huán)**；在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生有色菌落在SS培養(yǎng)基上:大腸桿菌一般不能生長(zhǎng)，少數(shù)生長(zhǎng)的菌落也因發(fā)酵乳糖而呈紅色；在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上:生長(zhǎng)成紫黑色帶有金屬光澤的菌落；在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長(zhǎng)，形成莢膜，管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。第6頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)概述3)生化特性

大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖：葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；大部分菌株可迅速發(fā)酵乳糖，各菌株對(duì)蔗糖、水楊苷、衛(wèi)矛醇及棉子糖的發(fā)酵力不一致，吲哚＋，MR＋，V－P－，枸櫞酸胺鹽－(IMVC++--)，尿素酶－，硫化氫－，氰化鉀培養(yǎng)基不中生長(zhǎng)，丙二酸鹽利用－，可使谷氨酸和賴氨酸脫羧基，苯丙氨酸－，氧化酶－，接觸媒＋。第7頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)3致病性(1)致病因素：①侵襲力②內(nèi)毒素③腸毒素①侵襲力大腸桿菌具有K抗原和菌毛：K抗原：有抗吞噬作用，有抵抗抗體和補(bǔ)體的作用菌毛：能幫助細(xì)菌粘附于粘膜表面。有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥。②內(nèi)毒素大腸桿菌細(xì)胞壁具有內(nèi)毒素的活性：其脂類A是毒性部位

特異多糖有助于細(xì)菌抵抗宿主的防御機(jī)制。概述第8頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)概述③腸毒素大腸埃希氏菌腸毒素有兩種：

a.不耐熱腸毒素(LT)：蛋白質(zhì)，加熱65℃經(jīng)30min即被破壞，促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞大量分泌腸液,引起腹瀉；

生食b.耐熱腸毒素(ST)，ST無(wú)免疫性，耐熱，100℃經(jīng)10-20min不被破壞，它也可引起腹瀉。第9頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)概述(2)所致疾病①腸外感染①腸外感染泌尿系統(tǒng)感染敗血癥膽囊炎肺炎新生兒或嬰兒腦膜炎等。

第10頁(yè)/共38頁(yè)概述②腹瀉4種大腸桿菌都可引起腹瀉：

產(chǎn)毒素大腸桿菌--是嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要原因；

致病性大腸桿菌--是嬰兒腹瀉的主要原因，嚴(yán)重者可致死；

侵襲性大腸桿菌--主要引起較大兒童和成年人腹瀉，有時(shí)甚至可引起爆發(fā)流行；

出血性大腸埃希氏菌O157--引起的主要臨床癥狀是腹瀉(重者水樣腹瀉)、腹痛、嘔吐，是老幼患者死亡的主要原因。食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)第11頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)第一法：MPN法第二法：VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法第三法：Petrifilm測(cè)試片法第12頁(yè)/共38頁(yè)大腸菌群計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流程0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣（-）小導(dǎo)管里無(wú)氣泡LST產(chǎn)氣（+）食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)MPN法第13頁(yè)/共38頁(yè)第二法VRBA平板計(jì)數(shù)法選擇15~150平板計(jì)數(shù)典型和可疑菌落36℃±1℃18h~24h挑選10個(gè)菌落接種到BGLB典型菌落為紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)，0.5mm食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)MPN法第14頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)MPN法大腸桿菌計(jì)數(shù)MPN法檢驗(yàn)程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍稀釋選擇3個(gè)連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST48±2h36℃±1℃不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EC肉湯45℃±0.2℃24±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣EMB瓊脂平板36℃±1℃24±2h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)生化試驗(yàn)，革蘭染色查MPN表，報(bào)告第15頁(yè)/共38頁(yè)如何報(bào)告結(jié)果？根據(jù)經(jīng)確證后的對(duì)應(yīng)濃度陽(yáng)性管數(shù)查MPN表MPN：最可能數(shù)，基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法陽(yáng)性管數(shù)MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)MPN法第16頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)美國(guó)食品藥品管理局（FDA）：BacteriologicalAnalyticalManual，2002，Chapter4：EnumerationofEscherichiacoliandtheColiformBacteria原理：由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解β-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基傘形酮游離出來(lái)，在366nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。觀察到藍(lán)色熒光即可認(rèn)為是大腸桿菌陽(yáng)性。4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷（MUG）對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖既沒(méi)有抑制作用也沒(méi)有促進(jìn)作用，對(duì)菌落形態(tài)也沒(méi)有影響。VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法第二法VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法第17頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個(gè)適宜稀釋度的樣液，接種VRBA-MUG平板紫外光下，計(jì)數(shù)發(fā)熒光的菌落報(bào)告結(jié)果36℃±1℃18~24h第18頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)由希華,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快速測(cè)定水中糞大腸菌群[J/OL].中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè),2019(02):1-5[2019-05-10]./10.19316/j.issn.1002-6002.2019.02.13.VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法選擇不同的地表水廢水樣品進(jìn)行熒光法與多管發(fā)酵法比對(duì)測(cè)試，討論方法適用性。熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相第19頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)PetrifilmTM測(cè)試片法第三法PetrifilmTM測(cè)試片法

PetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌群測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和葡萄糖苷酶指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。E.coli能產(chǎn)生-葡萄糖苷酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)藍(lán)點(diǎn)帶氣泡的菌落即為大腸桿菌數(shù)，紅點(diǎn)帶氣泡和藍(lán)點(diǎn)帶氣泡的菌落之和為大腸菌群數(shù)。第20頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)PetrifilmTM測(cè)試片法大腸桿菌PetrifilmTM測(cè)試片檢驗(yàn)程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2~3個(gè)適宜稀釋度的樣液，接種PetrifilmTM大腸桿菌測(cè)試紙片計(jì)數(shù)藍(lán)色帶氣泡菌落報(bào)告結(jié)果36℃±1℃24±2h或48±2h第21頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)PetrifilmTM測(cè)試片法史夢(mèng)雨.消毒餐飲具中大腸菌群的兩種方法比較[J].中國(guó)城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2018,33(12):76-77.

第22頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)PetrifilmTM測(cè)試片法第23頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)大腸菌群控制大腸菌群控制（冷凍飲品生產(chǎn)為例子）人機(jī)料法環(huán)第24頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)大腸菌群控制“人”①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施，獨(dú)立設(shè)置更衣間與消毒間，更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。

②消毒間安裝洗手池、酒精噴淋器、干手器。③車間進(jìn)入門口放鞋靴消毒池。④嚴(yán)格規(guī)定進(jìn)入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手，必須穿經(jīng)消毒的工作衣，更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進(jìn)入車間。第25頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)大腸菌群控制“機(jī)”①嚴(yán)格落實(shí)《生產(chǎn)設(shè)施、設(shè)備清洗消毒制度》，定期對(duì)生產(chǎn)設(shè)備及管道用CIP清洗消毒或用90℃以上的熱水消毒，預(yù)防大腸菌群的滋生和繁殖。②一旦產(chǎn)品中檢出大腸菌群，要對(duì)生產(chǎn)設(shè)備和管道進(jìn)行徹底消毒。第26頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)大腸菌群控制“料”①嚴(yán)格驗(yàn)收原輔料，重點(diǎn)查驗(yàn)大腸菌群項(xiàng)目，盡可能購(gòu)買不含大腸菌群原輔料。②對(duì)原料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有檢驗(yàn)大腸菌群的進(jìn)行自檢，做到心中有數(shù)。③定期自檢生產(chǎn)用水，必要時(shí)進(jìn)行殺菌處理。④包裝袋使用前進(jìn)行紫外殺菌處理。第27頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)大腸菌群控制“法”①滅菌一定要徹底，一般溫度在90℃以上，滅菌15min以上，就能使產(chǎn)品達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)。②注模消毒后一定要用無(wú)菌水進(jìn)行沖洗，避免注模二次污染。③要避免交叉污染，嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)生區(qū)和熟區(qū)。第28頁(yè)/共38頁(yè)食品中大腸桿菌的檢驗(yàn)大腸菌群控制“環(huán)”①在生產(chǎn)車間安裝足夠的紫外滅菌燈，對(duì)生產(chǎn)環(huán)境定時(shí)殺菌。②生產(chǎn)車間定時(shí)通風(fēng)除濕，防止大腸菌群的滋生和繁殖。第29頁(yè)/共38頁(yè)*1993年，JackInTheBox快餐連鎖店出售未煮熟的污染漢堡引起700多人（以兒童為主）食物中毒，并造成4人死亡。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠(yuǎn)揚(yáng)。*2001年夏天，在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后，ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬(wàn)磅碎牛肉。美國(guó)疾病預(yù)防和控制中心估計(jì)，美國(guó)每年因大腸桿菌O157:H7致病總?cè)藬?shù)大約為73000人，盡管上報(bào)的病例已有所下降。*1998年，佐治亞州亞特蘭大水上公園發(fā)生的大腸桿菌O157:H7大爆發(fā)使得多名兒童住院。*1996年5-8月，日本中學(xué)和幼兒園相繼發(fā)生多起大腸桿菌O157集體中毒事件，波及44個(gè)地區(qū)，7萬(wàn)例，死亡12人.與芽菜有關(guān)。第30頁(yè)/共38頁(yè)益生菌：不致病，能合成維生素B和維生素K，生產(chǎn)大腸菌素，對(duì)機(jī)體有利；條件致病菌：在機(jī)體因內(nèi)外因素所致抵抗力下降或菌體侵入腸外組織或器官時(shí)條件下致病；致病菌：引起腸道感染的有四類：產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC）出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)

腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasiveE.coli，EIEC)

腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenicE.coli，EPEC）帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒最重要原因，人的帶菌亦可污染食品，引起中毒。第31頁(yè)/共38頁(yè)EMB瓊脂主要成分：乳糖、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng)：伊紅和美監(jiān)。原理：大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸，使伊紅與美藍(lán)結(jié)合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍(lán)二者的比例有關(guān)。不發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌，在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍(lán)結(jié)合，因而形成無(wú)色的菌落。部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。（應(yīng)注意非典型的菌落）。典型菌落：具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的菌落。非典型的可疑菌落：粉紅色，無(wú)黑心第32頁(yè)/共38頁(yè)靛基質(zhì)試驗(yàn)：甲基紅試驗(yàn)：V-P試驗(yàn)：檸檬酸鹽試驗(yàn)：第33頁(yè)/共38頁(yè)

4、甲基紅（MR）試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)二、常見(jiàn)生理生化試驗(yàn)

糖（醇）類代謝試驗(yàn)1、MR試驗(yàn)原理：一些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸