中藥制劑分析新技術(shù)新方法

中國藥典中藥分析方法發(fā)展趨勢1977版藥典收載顯微鑒別1985版藥典收載TLC鑒別1990版藥典收載對照藥材的TLC鑒別和色譜方法的含量測定2000版藥典建立了以色譜法含量測定為主導(dǎo)的質(zhì)控方法2005版藥典大幅度增加HPLC方法，重視特征成分、活性成分的測定2010版藥典增加了指紋圖譜的測定趨勢：新方法新技術(shù)不斷引入中藥的質(zhì)量控制中。目前一頁\總數(shù)四十八頁\編于一點高效毛細(xì)管電泳2中藥指紋圖譜3中藥化學(xué)指紋圖譜技術(shù)、中藥DNA指紋圖譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)1頂空氣相色譜法、超高效液相色譜、超臨界流體色譜提綱OUTLINE目前二頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§1現(xiàn)代色譜技術(shù)1、頂空氣相色譜法（液上氣相色譜法、頂空分析法）對樣品基質(zhì)上方的氣體成分進(jìn)行GC分析來測定這些組分在原樣品中的含量頂空氣相色譜的分類靜態(tài)頂空GC動態(tài)頂空GC目前三頁\總數(shù)四十八頁\編于一點1、頂空氣相色譜法主要特點：樣品前處理簡單檢測限低可分析含量低、組成復(fù)雜的樣品適用于易揮發(fā)或易分解或無法直接進(jìn)樣分析的液體或固體樣品的分析§1現(xiàn)代色譜技術(shù)目前四頁\總數(shù)四十八頁\編于一點頂空氣相色譜法應(yīng)用實例頂空固相微萃取-氣相色譜法測定魚腥草注射液中甲基正壬酮含量樣品制備：精密量取魚腥草注射液1ml，置頂空取樣瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)物溶液50μl，搖勻，密封，作為供試品溶液。色譜條件（略）頂空分析條件平衡溫度為50℃，平衡時間為10分鐘（快速攪拌下），閥、輸送管及定量管溫度為80℃，加壓為13.8kPa，加壓時間、充樣時間和壓力平衡時間均為0.15分鐘，定量管為1.0ml?！?現(xiàn)代色譜技術(shù)目前五頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§1現(xiàn)代色譜技術(shù)2、超高效液相色譜（UPLC，UltraPerformanceLiquidChromatography）主要特點固定相雙（三乙氧基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團顆粒粒度小，僅為1.7μm耐壓，顆粒度分布范圍很窄目前六頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§1現(xiàn)代色譜技術(shù)2、超高效液相色譜（UPLC，UltraPerformanceLiquidChromatography）主要特點檢測器響應(yīng)快樣品池—10mm的光程（與普通HPLC相同）而體積只有500nL（普通HPLC的20分之一）優(yōu)點更高的分析速度，更好分離效果和更高的靈敏度，速度、靈敏度及分離度，分別是HPLC的9倍、1.7倍及3倍目前七頁\總數(shù)四十八頁\編于一點樣品的前處理分子印跡技術(shù)制備對特定目標(biāo)分子具有分子識別性能的分子印跡聚合物的技術(shù)。分子印跡聚合物兼?zhèn)淞松镒R別體系和化學(xué)識別體系的優(yōu)點,具有抗惡劣環(huán)境、選擇性高、穩(wěn)定性好、機械強度高、制備簡單等特點,可選擇性識別富集復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物。用于固相萃取、固相微萃取、膜萃取等樣品前處理技術(shù)。目前八頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§1現(xiàn)代色譜技術(shù)3、超臨界流體色譜（SFC,supercriticalfluidchromatography）以超臨界流體（低黏度、高密度以及較高的擴散系數(shù)）作為流動相。對GC及HPLC的檢測器均可兼容使用適用于分析GC難以處理的高沸點、不揮發(fā)性樣品分離速度較HPLC，分離效果更好。應(yīng)用實例超臨界流體色譜法測定懷牛膝制劑中齊墩果酸的含量目前九頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§2高效毛細(xì)管電泳電泳:在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。1937年Tiselius(瑞典)利用自由溶液電泳將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白1981年Jorgenson和Luckas發(fā)展了高效毛細(xì)管電泳分離分析技術(shù)(使用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管和采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓)，目前十頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§2高效毛細(xì)管電泳

各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致

可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離分離原理電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

目前十一頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§2高效毛細(xì)管電泳儀器裝置電壓：0～30KV。分離柱不涂敷任何固定液，紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器可檢測到：10-19～10-21mol/L目前十二頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§2高效毛細(xì)管電泳主要特點優(yōu)點高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。高靈敏度：可檢測出低至10-21mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL（10-9L）的試樣儀器簡單，操作成本低：分析一個試樣僅需幾毫升流動液目前十三頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§2高效毛細(xì)管電泳常見的毛細(xì)管電泳模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)毛細(xì)管膠束電動色譜(MECC)（膠束作為假固定相的電動色譜）毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)（凝膠作為支持物，起分子篩的作用）毛細(xì)管等電聚焦電泳(CIEF)（用于蛋白質(zhì)、多肽等兩性物質(zhì)的分離）毛細(xì)管等速電泳(CITP)目前十四頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§2高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用離子分析藥物分析手性化合物分析氨基酸分析核酸分析及DNA測序HPCE在中藥制劑分析中的應(yīng)用生物堿的測定、動物類藥材的鑒別、指紋圖譜目前十五頁\總數(shù)四十八頁\編于一點高效毛細(xì)管電泳法測定心舒口服液中腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量對照品溶液（略）供試品溶液的配制取心舒口服液10mL，加熱濃縮至約1mL，加60%甲醇定容10mL，冰箱放置過夜，經(jīng)0.45mm濾膜濾過備用。電泳條件以熔融石英毛細(xì)管(50mm×66.5cm，有效分離長度58cm)為分離通道，以105mmol/L硼砂液為運行緩沖液，壓力進(jìn)樣50mpa，6s，毛細(xì)管柱溫度為20℃，運行電壓為0～30min:24kV，30～60min:28kV，檢測波長為210nm，毛細(xì)管柱使用前以0.1mol/L氫氧化鈉溶液、注射用水和運行緩沖液依次沖洗5,5,8min，每次電泳后以運行緩沖液沖洗8min。在此條件下，同時測定腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量。目前十六頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§3中藥指紋圖譜從整體上評價中藥的內(nèi)在質(zhì)量中藥（化學(xué)）指紋圖譜法現(xiàn)代光譜（紅外光譜，紫外光譜）色譜（氣相色譜、薄層色譜、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳）其它（X光衍射）目前十七頁\總數(shù)四十八頁\編于一點§3中藥指紋圖譜中藥DNA指紋圖譜法——DNA分子遺傳標(biāo)記DNA分子：遺傳信息的直接載體，物種鑒別更為準(zhǔn)確可靠90年代，PCR(PolymoraseChainReaction)技術(shù)，快速而靈敏地檢測。近年來，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等檢測DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)（DNA指紋技術(shù)）。應(yīng)用：在藥材鑒定方面目前十八頁\總數(shù)四十八頁\編于一點廣義的分子標(biāo)記（molecularmarker）是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。常用的是狹義的分子標(biāo)記概念，即DNA分子標(biāo)記。DNA分子標(biāo)記主要分為以下三類限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)，以分子雜交為核心技術(shù)。DNA序列測定目前十九頁\總數(shù)四十八頁\編于一點基于PCR的分子標(biāo)記：根據(jù)引物的選擇可分為隨機引物擴增和特定序列位點擴增。隨機擴增多態(tài)性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。隨機引物擴增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）目前二十頁\總數(shù)四十八頁\編于一點2、DNA擴增產(chǎn)物指紋分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:與RAPD技術(shù)不同的是引物濃度更高，長度更短（5～8個bp），只有2個溫度循環(huán)（在RAPD中是3個溫度循環(huán)），一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、特征擴增區(qū)段測序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行測序，根據(jù)RAPD片段兩末端的序列設(shè)計特定引物（一般比RAPD引物長，24bp），再進(jìn)行PCR擴增，可把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒定出來，可重復(fù)性高。目前二十一頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RFLP技術(shù)及其應(yīng)用

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性)是70年代發(fā)展起來的DNA片段分析技術(shù)。該技術(shù)不僅在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)的許多領(lǐng)域都有了成功的應(yīng)用，而且在中藥材品種基源及其地理品系、栽培品系的質(zhì)量評價方面也有許多應(yīng)用。目前二十二頁\總數(shù)四十八頁\編于一點基本原理

生物在進(jìn)化過程中，由于種種原因引起基因突變和DNA分子結(jié)構(gòu)重排，造成了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，當(dāng)這種改變涉及到限制性酶切位點時，酶切后產(chǎn)生的DNA片段長度將發(fā)生變化，限制性片段的長度在不同個體間呈多態(tài)性現(xiàn)象，即稱為限制性片段長度多態(tài)(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,簡稱RFLP)目前二十三頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes:6-cutterGAATTC 4-cutterTCGACTTAAG AGCT目前二十四頁\總數(shù)四十八頁\編于一點目前二十五頁\總數(shù)四十八頁\編于一點DNA多態(tài)性根據(jù)其產(chǎn)生的兩種基本方式堿基對突變類型(基因點突變),即限制性內(nèi)切酶識別位點上發(fā)生了單個堿基替換(轉(zhuǎn)換或顛換)，使原有切點消失或產(chǎn)生新的切點。結(jié)構(gòu)重排型，這是由DNA內(nèi)部發(fā)生較大的順序變化所引起的。目前二十六頁\總數(shù)四十八頁\編于一點目前二十七頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RFLP與鐮狀細(xì)胞貧血目前二十八頁\總數(shù)四十八頁\編于一點基本實驗步驟靶DNA的準(zhǔn)備核酸探針的標(biāo)記雜交顯示目前二十九頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RFLP的優(yōu)點及局限性

優(yōu)點：(1)普遍存在(2)穩(wěn)定性(3)共顯性(4)探針與限制酶的組合數(shù)量無限局限性：（1）用RFLP僅能檢測出影響到限制性內(nèi)切酶識別位點的突變（2）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多（3）RFLP分析技術(shù)要求DNA無顯著降解，因此只適用于新鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別（4）限制性內(nèi)切酶價格較貴

目前三十頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RFLP用于親緣關(guān)系分析“Ladder”目前三十一頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RFLP在中藥材鑒別中的應(yīng)用

（一）近緣種的鑒別如：海馬的PCR-RFLP分析

（二）藥用植物親緣關(guān)系的研究如：羽扇豆屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及與生物堿分布的關(guān)系

目前三十二頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RAPD技術(shù)及其應(yīng)用

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)技術(shù)是1990年由杜邦公司W(wǎng)illiams和Welsh兩個研究小組同時發(fā)展起來的一項DNA多態(tài)檢測技術(shù)。該技術(shù)高效、靈敏、簡便、快速，一經(jīng)出現(xiàn)就被普遍用于物種種屬分類、親緣關(guān)系分析、物種起源鑒定、目的基因篩選、農(nóng)作物育種等研究領(lǐng)域。近年，RAPD技術(shù)又進(jìn)入了中藥材的鑒別研究領(lǐng)域，并得到廣泛應(yīng)用，已成為目前用于中藥材鑒定報道最多的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)。目前三十三頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RAPD技術(shù)基本原理RAPD的核心技術(shù)是PCR反應(yīng)，但又不同于經(jīng)典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸為引物進(jìn)行PCR擴增，Williams稱之為RAPD，引物通常為10個堿基；Welsh稱之為AP-PCR(ArbitraryPrimerPCR)，引物為20～30個堿基。對于任一引物，如在一定范圍內(nèi)模板DNA上有與之互補的反向重復(fù)序列時，就可擴增出此范圍的DNA片段。目前三十四頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA目前三十五頁\總數(shù)四十八頁\編于一點基本實驗步驟

模板DNA的制備PCR擴增，通常RAPD擴增條件為：93℃預(yù)變性200s，開始如下循環(huán)：94℃變性lmin，36℃退火1min，72℃延伸2min；經(jīng)過40個循環(huán)后，72℃延伸5min，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。擴增產(chǎn)物20μl反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測擴增的情況RAPD圖譜的數(shù)據(jù)處理目前三十六頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RAPD分析的優(yōu)越性和不足優(yōu)越性：(1)無需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無需專門設(shè)計RAPD擴增反應(yīng)的引物，引物隨機合成或是任意選定的,長度一般為9-10個寡核苷酸；(2)擴增沒有特異性；(3)退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對，同時也允許了適當(dāng)?shù)腻e誤配對，以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。(4)簡便易行，省力省時。（5）檢測靈敏方便；（6）所需樣品DNA量極少，僅為10ng,為RFLP的1/l000～l/2000。（7）能自動化。目前三十七頁\總數(shù)四十八頁\編于一點不足：（1）重復(fù)性不高。RAPD在擴增反應(yīng)時使用的是低溫復(fù)性(通常為36℃),特異性不高,引物與模板間有較高的錯配率,結(jié)果容易受到多種因素的影響,不同的實驗室這間有時不能重復(fù)；（2）對模板DNA質(zhì)量要求高，操作要求嚴(yán)格，檢驗成本相對較高；（3）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴增產(chǎn)物；（4）RAPD標(biāo)記難以區(qū)分開雜合子和純合子基因型，不能有效的鑒定出雜合子。目前三十八頁\總數(shù)四十八頁\編于一點RAPD分析在中藥研究中的應(yīng)用

道地藥材的評價

例：當(dāng)歸藥材道地性的RAPD分析野生與栽培種及不同農(nóng)家品種親緣關(guān)系分析例：人參及山參RAPD指紋動物藥的鑒定

例：蛇類藥材分子遺傳標(biāo)記鑒別的研究目前三十九頁\總數(shù)四十八頁\編于一點AFLP技術(shù)及其應(yīng)用

擴增酶切片段多態(tài)性(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)是一種基于PCR的DNA指紋技術(shù)，AFLP是近幾年來繼RFLP、RAPD之后發(fā)展最快的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。被譽為新一代的分子標(biāo)記技術(shù)，近年來已得到廣泛的應(yīng)用。目前四十頁\總數(shù)四十八頁\編于一點AFLP基本原理

AFLP的基本原理是對基因組DNA限制性酶切片段進(jìn)行選擇性擴增。先將基因組DNA用限制性酶消化，產(chǎn)生粘性末端。然后使用人工合成的雙鏈接頭（artificialadapter）,與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴增反應(yīng)的模板