核酸化學(xué)理化性質(zhì)

第一節(jié).核酸概述(ɡàishù)第二節(jié).核酸的結(jié)構(gòu)第三節(jié).核酸的物理化學(xué)性質(zhì)第四節(jié).核酸的研究方法第一頁(yè)，共45頁(yè)。1核酸的理化性質(zhì)第三節(jié)目錄P503第二頁(yè)，共45頁(yè)。2一、核酸(hésuān)的一般性質(zhì)(了解)①核酸和核苷酸既有磷酸基，又有堿性基團(tuán)，所以是兩性電解質(zhì)，由于磷酸酸性較強(qiáng)常表現(xiàn)酸性。②晶形-DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。③粘度—大多數(shù)DNA為線性分子，分子極不對(duì)稱(duìchèn)，長(zhǎng)度可達(dá)幾厘米，而直徑只有幾納米，所以即使是極稀的DNA溶液，也有極大的粘度，RNA溶液的粘度要小得多。④溶解性：微溶于水(溶液呈酸性)，不溶于一般有機(jī)溶劑，在70%乙醇中形成沉淀==>用70-95%乙醇提純核酸。核苷酸無(wú)色、溶于水。RNA易溶于低鹽(0.14MNaCl)，DNA易溶于高鹽濃度(1MNaCl)。室溫下，稀堿能水解RNA，而DNA穩(wěn)定。稀酸可水解DNA，而濃酸可水解RNA。⑤旋光性-均很強(qiáng)第三頁(yè)，共45頁(yè)。3二、核酸(hésuān)的水解(P503,掌握)核酸堿基與戊糖形成(xíngchéng)的N-糖苷鍵。磷酸基與兩種糖分別形成(xíngchéng)核糖磷酸酯和脫氧核糖磷酸酯。這些糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸或堿和酶水解。第四頁(yè)，共45頁(yè)。4糖苷鍵和磷酸酯鍵都能發(fā)生酸水解，但糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解。嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶(mìdìnɡ)堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定。對(duì)酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。DNA在pH1.6于37℃對(duì)水透析即可完全除去嘌呤堿。在pH2.8于100℃加熱1h，也可完全除去嘌呤堿。水解嘧啶(mìdìnɡ)堿需要較高的溫度。用甲酸〔98％-100％〕密封加熱至175℃2h，無(wú)論RNA還是DNA都可以完全水解，產(chǎn)生嘌呤和嘧啶(mìdìnɡ)堿，缺點(diǎn)是尿嘧啶(mìdìnɡ)的回收率較低。改用三氟乙酸在155℃加熱60min〔水解DNA〕或80min〔水解RNA〕，嘧啶(mìdìnɡ)堿的回收率顯著提高。1．酸水解(shuǐjiě)第五頁(yè)，共45頁(yè)。5RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸；用于水解RNA的堿有NaOH和KOH，以KON較好，堿濃度一般為0.3-1mol/L，在室溫至37℃下水解18～24h即可水解完全。DNA的磷酸酯鍵那么不易被堿水解。DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定(wěndìng)，在1mol/LNaOH中加熱至100℃4h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。2．堿水解(shuǐjiě)第六頁(yè)，共45頁(yè)。6總結(jié)(zǒngjié)．酸或堿的水解核酸分子中的磷酸(línsuān)二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對(duì)酸或堿的耐受程度有很大差異。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸(línsuān)核苷；DNA在同樣條件下那么不受影響。這種水解性能上的差異？與RNA核糖基上2′-OH的鄰基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時(shí)，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸(línsuān)基，在斷開磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸(línsuān)二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。第七頁(yè)，共45頁(yè)。7水解核酸的酶類很多。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶稱為磷酸二酯酶，如蛇毒(shédú)磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。第八頁(yè)，共45頁(yè)。8①按底物專一性分類兩類：以DNA為底物的DNA水解酶〔DNases〕和以RNA為底物的RNA水解酶〔RNases〕。②根據(jù)作用方式分兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。作用位點(diǎn)在多核苷酸鏈內(nèi)部的為核酸內(nèi)切酶。從多核苷酸鏈的末端開始，逐個(gè)的將核苷酸切下，從而使核酸進(jìn)行(jìnxíng)降解的酶稱為外切酶。③按磷酸二酯鍵斷裂的方式分兩類：一種是在3’-OH與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是5’-核苷酸或寡聚核苷酸。另一種是在5’-OH與磷酸基之間斷裂，其產(chǎn)物是3’-核苷酸或寡聚核苷酸。④其它分類標(biāo)準(zhǔn)還有對(duì)底物二級(jí)結(jié)構(gòu)的專一性，作用于雙鏈核酸的叫雙鏈酶，作用于單鏈的叫單鏈酶。核酸外切酶作用的方向性，3’→5’或5’→3’。對(duì)磷酸二酯鍵兩側(cè)的堿基有無(wú)選擇性等?！?〕核酸酶的分類(fēnlèi)第九頁(yè)，共45頁(yè)。9①牛胰核糖核酸酶〔RNaseI〕只作用于RNA，不作用于DNA。且具有極高專一性的酶，其作用位點(diǎn)是嘧啶核苷-3’-磷酸(línsuān)與其他核苷酸之間的鍵〔5’-磷酸(línsuān)酯鍵〕。產(chǎn)生3’-嘧啶核苷酸或以3’-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。(P503)②核糖核酸酶T1具有比RnaseI更高的專一性。他作用的位點(diǎn)是3’-鳥苷酸與其相鄰核苷酸的5’-OH之間的連鍵。產(chǎn)生3’-鳥苷酸或以3’-鳥苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。③核糖核酸酶T2主要作用點(diǎn)為Ap殘基，可以將tRNA完全降解成3’-腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸?！?〕核糖核酸(hétánɡhésuān)酶類〔RNase〕第十頁(yè)，共45頁(yè)。10①牛胰脫氧核糖核酸酶〔DNaseI〕切斷雙鏈DNA或單鏈DNA成為以5’-磷酸為末端的寡核苷酸，平均長(zhǎng)度為4核苷酸。②牛脾脫氧核糖核酸酶〔DnaseII〕降解DNA成為3’-磷酸為末端的寡核苷酸，平均長(zhǎng)度為6核苷酸。③鏈球菌脫氧核糖核酸酶核酸內(nèi)切酶，作用于DNA，產(chǎn)物為5’-磷酸為末端長(zhǎng)度不同的碎片。④限制性內(nèi)切酶在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)(fāxiàn)，主要降解外源DNA。具有嚴(yán)格的堿基序列專一性。它能專一識(shí)別并切割DNA上特定堿基序列，產(chǎn)物仍為雙鏈DNA片段。限制內(nèi)切酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)通常是4-6bp組成的回文結(jié)構(gòu)。切開后的產(chǎn)物具有粘性末端。限制性內(nèi)切酶在基因工程中得到廣泛應(yīng)用?！?〕N-糖苷酶—水解糖苷鍵?！?〕脫氧核糖核酸酶〔DNase〕第十一頁(yè)，共45頁(yè)。11注：生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。以DNA為底物的DNA水解酶〔DNases〕和以RNA為底物的RNA水解酶〔RNases〕。根據(jù)作用(zuòyòng)方式又分作兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用(zuòyòng)方式是從多聚核苷酸鏈的一端〔3′-端或5′-端〕開始，逐個(gè)水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用(zuòyòng)方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價(jià)值的是限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。第十二頁(yè)，共45頁(yè)。12核酸的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團(tuán)〔磷酸基〕也含有堿性基團(tuán)〔氨基(ānjī)〕，因而核酸也具有兩性性質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性〔氨基(ānjī)〕是一個(gè)弱堿，所以核酸的等電點(diǎn)比較低。如；。RNA的等電點(diǎn)比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通過(guò)氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNA沒(méi)有這種作用。三、核酸(hésuān)的酸堿性質(zhì)(P504,了解)第十三頁(yè)，共45頁(yè)。13堿基的堿性(jiǎnxìnɡ)嘌呤堿基和嘧啶堿基都具有弱堿性(jiǎnxìnɡ)。環(huán)內(nèi)氨基的pKa值約為9.5。堿基環(huán)外的氨基〔存在于A、G和C〕的堿性(jiǎnxìnɡ)很弱，在生理pH條件下不能被質(zhì)子化。這種情況與苯胺分子中的氨基相似。因此嘌呤和嘧啶堿基的堿性(jiǎnxìnɡ)主要是環(huán)內(nèi)氨基的奉獻(xiàn)。第十四頁(yè)，共45頁(yè)。14四.核酸的紫外吸收(xīshōu)(P507，了解)在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，使DNA和RNA在240～290nm處有強(qiáng)烈紫外吸收，最大吸收峰在260nm左右，可以作為核酸及其組份定性和定量(dìngliàng)測(cè)定的依據(jù)。以A260/A280進(jìn)行定性、定量(dìngliàng)DNA和RNA溶液中參加溴化乙錠〔EB〕，在紫外下發(fā)出熒光第十五頁(yè)，共45頁(yè)。15第十六頁(yè)，共45頁(yè)。161.用A260/A280判斷核酸樣品(yàngpǐn)的純度：由于核酸的紫外吸收最大吸收值在260nm處。蛋白質(zhì)最大吸收值在280nm處。利用這一特性，可以鑒別核酸樣品(yàngpǐn)中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，還可以對(duì)核酸進(jìn)行定量測(cè)定。用OD260/OD280比值來(lái)判斷樣品(yàngpǐn)純度。一般純DNA比值≥，純RNA比值應(yīng)到達(dá)，假設(shè)含雜蛋白及苯酚，比值會(huì)明顯下降。2.對(duì)于純的DNA或RNA樣品(yàngpǐn)，可用該法作定量測(cè)定50μg/ml雙鏈DNA通常當(dāng)相當(dāng)于：40μg/ml單鏈DNA〔或RNA〕20μg/ml寡核苷酸優(yōu)點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、所需樣品(yàngpǐn)量少OD260的應(yīng)用(yìngyòng)目錄第十七頁(yè)，共45頁(yè)。17五．核酸的變性、復(fù)性(fùxìnɡ)與雜交問(wèn)：核酸變性與核酸降解的區(qū)別？核酸的變性只涉及雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。問(wèn)：核酸變性后物化性質(zhì)也會(huì)發(fā)生哪些變化呢？答案：粘度下降(xiàjiàng)；紫外吸收值A(chǔ)急劇增加；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變；生物活性喪失等。(1)核酸的變性(biànxìng)(P508,掌握)1.定義：指高溫、酸堿以及某些變性(biànxìng)劑能破壞核酸中的氫鍵，使有規(guī)律的雙螺旋型結(jié)構(gòu)變成單鏈的、無(wú)規(guī)律的“線團(tuán)〞，這種作用就稱為核酸的變性(biànxìng)。第十八頁(yè)，共45頁(yè)。18DNA變性(biànxìng)的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂第十九頁(yè)，共45頁(yè)。192.引起核酸變性的因素：很多由溫度(wēndù)升高引起的變性稱為熱變性；由酸堿度改變引起的變性稱酸堿變性；變性試劑如尿素、甲醛、胍類、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等均可引起核酸的變性。第二十頁(yè)，共45頁(yè)。20DNA的熔點(diǎn)(róngdiǎn)其中DNA的熱變性一般在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，很像固體結(jié)晶物質(zhì)在其熔點(diǎn)突然熔化的情況(qíngkuàng)。因此通常把加熱變性使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為熔點(diǎn)或溶解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在82-95C之間。第二十一頁(yè)，共45頁(yè)。21DNA變性是個(gè)突變過(guò)程，類似結(jié)晶的熔解(rónɡjiě)。的溫度稱熔解(rónɡjiě)溫度。通常將紫外吸收的增加量到達(dá)最大增量一半〔即加熱變性使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半〕時(shí)的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解(rónɡjiě)溫度(meltingtemperature,Tm)。TmTm第二十二頁(yè)，共45頁(yè)。22熱變性(biànxìng)解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度(wēndù)對(duì)A260〔absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率〕值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。目錄第二十三頁(yè)，共45頁(yè)。23第二十四頁(yè)，共45頁(yè)。24Tm：變性(biànxìng)是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值到達(dá)最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。目錄第二十五頁(yè)，共45頁(yè)。25①DNA的均一性均一性越高，DNA的解鏈溫度越窄。均質(zhì)DNA熔解(rónɡjiě)過(guò)程發(fā)生在一個(gè)較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解(rónɡjiě)過(guò)程發(fā)生在一個(gè)較寬的溫度范圍內(nèi)。Tm值可作為衡量DNA樣品均一性的標(biāo)準(zhǔn)。②G-C的相對(duì)含量越多，Tm值越高。G和C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式推算Tm值或G-C含量：〔G+C)%=〔Tm-69.3〕×2.44問(wèn)：DNA的Tm值與哪些因素有關(guān)(yǒuguān)呢？第二十六頁(yè)，共45頁(yè)。26③介質(zhì)中的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度較低，DNA溶解溫度較低，且溶解溫度范圍較寬。離子強(qiáng)度較高，DNA溶解溫度較高，且溶解溫度范圍較窄。故DNA不應(yīng)保存在極烯的溶液中。④pH值的影響高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的能力。⑤變性劑的影響如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，阻礙(zǔài)堿基堆積，使Tm下降。第二十七頁(yè)，共45頁(yè)。27由于RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNA那樣明顯。具體：變性曲線不那么陡，Tm值也較低。利用紫外吸收的變化，可以檢測(cè)核酸變性的情況。例如，天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260nm)值增加(zēngjiā)25－40%.而RNA變性后，約增加(zēngjiā)1.1%。這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng).的變性(biànxìng)第二十八頁(yè)，共45頁(yè)。28變性后的核酸在260nm處的紫外吸收明顯升高，稱增色效應(yīng)。核酸復(fù)性后，光吸收值又回復(fù)到原有水平〔減色效應(yīng)〕。這是檢測(cè)(jiǎncè)核酸變性的一個(gè)最簡(jiǎn)便的方法。思考：增色效應(yīng)的原因？當(dāng)核苷酸摩爾數(shù)相同時(shí)，A260值大小如下關(guān)系：?jiǎn)魏塑账?gt;單鏈DNA>雙鏈DNA4.增色(zēnɡsè)效應(yīng)的原因(P508)第二十九頁(yè)，共45頁(yè)。29DNA復(fù)性的定義在適當(dāng)條件(tiáojiàn)下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。減色效應(yīng)：DNA復(fù)性(fùxìnɡ)時(shí)，其溶液OD260降低。熱變性(biànxìng)的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程稱為退火(annealing)。退火溫度＝Tm－25℃目錄(2)核酸的復(fù)性(P508,掌握)第三十頁(yè)，共45頁(yè)。30DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過(guò)程的條件有關(guān)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是(dànshì)將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。復(fù)性影響因素：分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。第三十一頁(yè)，共45頁(yè)。31影響復(fù)性(fùxìnɡ)速度的因素：〔1〕溶液溫度的上下〔Tm–25℃〕〔2〕單鏈片段的大小〔3〕單鏈片段濃度〔4〕片段內(nèi)重復(fù)序列的多少〔5〕溶液離子強(qiáng)度的大小第三十二頁(yè)，共45頁(yè)。32附：DNA的復(fù)性一般只適用于均一的病毒和細(xì)菌的DNA，至于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的非均一DNA，很難恢復(fù)到原來(lái)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。這是因?yàn)楦髌瑪嘀g只要有一定數(shù)量的堿基彼此互補(bǔ)，就可以重新組合成雙螺旋結(jié)構(gòu)，堿基不互補(bǔ)的區(qū)域那么形成突環(huán)。復(fù)性速度(sùdù)的因素影響：順序簡(jiǎn)單的DNA分子比復(fù)雜的分子復(fù)性要快；DNA濃度越高，越易復(fù)性；此外，DNA片斷大小、溶液的離子強(qiáng)度等對(duì)復(fù)性速度(sùdù)都有影響。復(fù)性后DNA的表現(xiàn)：物理化學(xué)性質(zhì)能得到恢復(fù)，如紫外光吸收值下降，粘度增高，比旋增加，生物活性也得到局部恢復(fù)。第三十三頁(yè)，共45頁(yè)。33DNA復(fù)性(fùxìnɡ)第三十四頁(yè)，共45頁(yè)。34A.概念:在DNA變性后的復(fù)性過(guò)程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液(róngyè)中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，在適宜的條件〔溫度及離子強(qiáng)度〕下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交1.核酸分子雜交的概念(gàiniàn)和原理(了解)(3)核酸(hésuān)的分子雜交(hybridization)簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)：在退火條件下，不同來(lái)源的DNA互補(bǔ)區(qū)形成氫鍵，或DNA單鏈和RNA鏈的互補(bǔ)區(qū)形成DNA-RNA雜合雙鏈的過(guò)程?？尚纬蒁NA—DNA雙鏈分子；DNA—RNA雙鏈分子；RNA—RNA雙鏈分子。第三十五頁(yè)，共45頁(yè)。35B.原理:是只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的同源性，在適宜的條件〔溫度及離子強(qiáng)度〕下，就可以按照(ànzhào)堿基互補(bǔ)配對(duì)原那么，在不同的分子間退火形成雜化雙鏈。第三十六頁(yè)，共45頁(yè)。36第三十七頁(yè)，共45頁(yè)。37DNA-DNA雜交(zájiāo)雙鏈分子變性復(fù)性不同(bùtónɡ)來(lái)源的DNA分子第三十八頁(yè)，