第七章抗原抗體反應(yīng)

第七章抗原抗體反應(yīng)1第1頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三ppt課件制作及講課原則自愿有興趣組織方式分組講選出最好在班上講內(nèi)容自選數(shù)量15張分別折算123次作業(yè)2第2頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三上章小結(jié)：一﹑基本概念主要組織相容性復(fù)合物等二﹑MHC抗原的結(jié)構(gòu)和功能

MHC-IMHC-II結(jié)構(gòu)、功能及兩者與肽結(jié)合的區(qū)別三﹑MHC抗原基因多態(tài)性及結(jié)構(gòu)四﹑MHC的檢測(cè)原理和應(yīng)用3第3頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第七章抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用一節(jié)﹑抗體的制備二節(jié)﹑抗原抗體反應(yīng)三節(jié)﹑抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用4第4頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一節(jié)﹑抗體的制備一﹑抗血清的制備及抗體純化二﹑單克隆抗體的制備三﹑抗體工程四﹑催化性抗體五﹑抗體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用繼續(xù)5第5頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

一﹑抗血清的制備及抗體純化

1、抗血清的制備抗血清：含有能與相應(yīng)抗原結(jié)合的抗體分子的免疫動(dòng)物血清。③抗血清的純化

見(jiàn)下圖①免疫動(dòng)物

抗原(半抗原需經(jīng)轉(zhuǎn)化)佐劑乳化免疫動(dòng)物②抗血清的制備

抗血清的效價(jià)測(cè)定采血獲得抗血清6第6頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三抗血清+3倍體積0℃ddH2O,調(diào)pH到7.7加50%-20℃酒精至最后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%(保持-5℃)上清沉淀(含IgG/IgA/IgM/雜蛋白)懸浮于0.015-0.02mol/L冷N(xiāo)aCl,用0.05mol/L醋酸調(diào)pH至5(<0℃)上清液沉淀(含IgA/IgM/雜蛋白)用0.5mol/LNaH2PO4調(diào)至pH7.4,-20至-30℃95%酒精至最后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，維持在-6℃上清沉淀(IgG)懸浮于ddH2O,用0.05mol/L醋酸調(diào)至pH5.1上清液沉淀調(diào)pH至5.5,離子強(qiáng)度為0.01—0.0075,加50%冷酒精至最后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%(-3℃)沉淀(IgA/IgM)上清通過(guò)分子篩將二者分開(kāi)2、抗體初步純化7第7頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

抗血清的初步純化只是多數(shù)抗體類(lèi)別的純化。上述冷酒精沉淀法是1946年Cohn創(chuàng)立的較好方法。該法得到的只是較粗Ig。硫酸銨鹽析法：比較簡(jiǎn)便，蛋白質(zhì)變性小，33%飽和硫鹽沉淀各類(lèi)Ig，分離純度較差。濃鹽使IgA形成二聚體，不宜采用。離子交換層析法：通過(guò)層析法，才能獲得高純度某一類(lèi)Ig。8第8頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3、抗體進(jìn)一步純化IgG在血清中含量最高，占75—80%，純化的方法常用33-50%硫銨鹽析和DEAE-纖維素柱層析法。IgG在pH7.5溶液中帶正電荷，其它血清蛋白都帶負(fù)電荷，因此可用陰離子交換劑DEAE-纖維素一次將IgG提純到很高的純度。分離純化IgM常用18%硫銨沉淀，再DEAE-纖維素柱層析，收集洗脫液，再用分子篩分離，獲純化的IgM。

獲得的純化Ig，在4℃保存，長(zhǎng)期保存需在-20℃以下。9第9頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

問(wèn)題：血清中的抗體是由多個(gè)抗原決定簇刺激B細(xì)胞克隆而產(chǎn)生的抗體，是多克隆抗體(PAb)，通過(guò)分離的方法不可能獲得真正的單一抗體。

如何獲得大量的一種抗體？由單一B細(xì)胞克隆而產(chǎn)生的抗體，稱(chēng)單克隆抗體(MAb)。二﹑單克隆抗體的制備10第10頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1

、制備MAb(monoclonalAb,mAb)的原理

利用B細(xì)胞能分泌抗體而腫瘤細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并可低溫保存的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)細(xì)胞雜交，融合二類(lèi)細(xì)胞，從而篩選得到既有抗體分泌性又有不斷分裂性的雜交瘤細(xì)胞，將其細(xì)胞單克隆化。用單克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)，稱(chēng)為雜交瘤技術(shù)。

該技術(shù)是1975年由G.K?hler&Milstein創(chuàng)立的。11第11頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2、制備MAb的基本過(guò)程免疫小鼠品種、加強(qiáng)3d脾臟單細(xì)胞懸浮洗掉血清骨髓瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷型PEGHAT培養(yǎng)基37℃5%CO2選抗體分泌株克隆陽(yáng)性細(xì)胞,1細(xì)胞/孔增殖陽(yáng)性克隆-70℃或液氮凍存細(xì)胞腹水制備擴(kuò)大培養(yǎng)中空纖維反應(yīng)器繼續(xù)12第12頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三返

ProceduresforProducingHybridomasandMonoclonalAntibodies13第13頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三用于制備B細(xì)胞的小鼠常用Balb/c品系，為H-2d單元(倍)型。B細(xì)胞從小鼠的脾臟制取。為保證B細(xì)胞有旺盛的分泌抗體活性，分離前3天一次靜脈加強(qiáng)免疫。B細(xì)胞要懸浮于沒(méi)有血清的培養(yǎng)液。?骨髓瘤細(xì)胞有多種細(xì)胞株，營(yíng)養(yǎng)缺陷型是一種。

缺陷是細(xì)胞缺少次黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)，另一條核酸合成必須酶。當(dāng)合成核酸的正常途徑被阻斷后（培養(yǎng)基中加入氨基喋呤），雖然培養(yǎng)基中有這二種底物(次黃嘌呤、胸腺嘧啶)，但缺陷細(xì)胞仍不能合成核酸而死亡。如果骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞發(fā)生了融合，因B細(xì)胞有正常的2套核酸合成酶系，正常途徑受阻后，能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)來(lái)合成核酸，因此融合后的雜交瘤細(xì)胞能在選擇培養(yǎng)基中正常分裂生長(zhǎng)。骨髓瘤細(xì)胞還應(yīng)該具有不能合成抗體或合成了也不能分泌的特性融合時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，B細(xì)胞有旺盛的分泌抗體活性。融合細(xì)胞按B細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞＝5—10：1，總細(xì)胞數(shù)在107--108水平。加入融合劑：50%的聚乙二醇(PEG)，37℃下融合1—2min。然后用培養(yǎng)液RMPI1640進(jìn)行洗滌稀釋?zhuān)コ齈EG后，于HAT培養(yǎng)基上培養(yǎng).14第14頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

篩選抗體分泌株：是將對(duì)HAT上形成的雜交瘤細(xì)胞集落進(jìn)行抗體活性檢測(cè)。

單克隆化：將多種細(xì)胞混合生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)分離為單克隆，

HAT:即含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)的選擇培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱(chēng)HAT。這種培養(yǎng)基能使雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞不能生長(zhǎng)，B細(xì)胞因本身在培養(yǎng)基中不能生存。這樣就能容易地將已經(jīng)發(fā)生了融合的雜交瘤細(xì)胞篩選出來(lái)，其它細(xì)胞自然被淘汰。返1215第15頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三抗體工程四催化性抗體五抗體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用16第16頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二節(jié)﹑抗原抗體反應(yīng)一、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)

★抗原與抗體的特異性結(jié)合,既可以發(fā)生在體內(nèi),也可發(fā)生在體外。發(fā)生在體外是許多免疫檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。

★抗原與抗體相互作用是非共價(jià)的、可逆的,其特性符合許多化學(xué)反應(yīng)的基本原理.

17第17頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

特異性抗原與抗體相互結(jié)合沒(méi)有共價(jià)鍵形成，只能通過(guò)次級(jí)鍵相互作用，在極短的距離內(nèi)才有效，因此抗原決定簇和抗體結(jié)合位點(diǎn)在空間上必須處于緊密接觸的狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力(親和力)。這種分子間的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)決定了抗原抗體結(jié)合的專(zhuān)一性。18第18頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三鹽鍵鹽鍵氫鍵疏水相互作用疏水相互作用范德華力范德華力次級(jí)鍵有:氫鍵范德華力疏水相互作用鹽鍵等19第19頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

抗原抗體結(jié)合的可逆性Ag＋AbAgAbK1K2抗原或半抗原與抗體之間的結(jié)合強(qiáng)弱稱(chēng)為親和力.抗原抗體結(jié)合松散，易于解離，親和力低，反之親和力高。20第20頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三[Ag]或[Ab][Ag-Ab]21第21頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

二抗體與單價(jià)抗原的作用三抗體與大分子多價(jià)抗原反應(yīng)

①大分子多價(jià)抗原

具有多個(gè)抗原決定簇，能與多個(gè)抗體結(jié)合的大分子物質(zhì)。

②抗原抗體的親和力和親合力

單價(jià)抗原與抗體的結(jié)合力，稱(chēng)親和力。多價(jià)抗原與抗體的總結(jié)合強(qiáng)度，稱(chēng)親合力。親合力大大強(qiáng)于每一位點(diǎn)的親和力，其強(qiáng)度的增加不僅僅是親和力的簡(jiǎn)單相加，是呈幾何級(jí)數(shù)上升的。

22第22頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

③抗原抗體反應(yīng)的表現(xiàn)——形成沉淀

與抗原抗體比例密切相關(guān)，一定濃度的抗體與一定濃度的抗原才能形成沉淀.抗原或抗體過(guò)剩都不能形成沉淀或很少。

抗體過(guò)量抗原抗體適量抗原過(guò)量網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō):認(rèn)為抗原抗體的結(jié)合包括許多抗原抗體相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。多價(jià)的抗體與多價(jià)的抗原反應(yīng)時(shí)，一個(gè)抗體可以結(jié)合二個(gè)或以上相同抗原的決定簇，一個(gè)抗原也能與多個(gè)抗體結(jié)合，從而形成相互交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)這些聚合達(dá)到一定大小時(shí)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。23第23頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

④交叉反應(yīng)

有幾個(gè)決定簇的兩個(gè)抗原，如果其中有一個(gè)決定簇相同，那么免疫獲得的抗體中就有能與兩種抗原上相同決定簇都能結(jié)合的一種抗體，即有交叉反應(yīng)現(xiàn)象。如M抗原和N抗原MACDBNFHJB24第24頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三﹑抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用1﹑免疫沉淀2﹑免疫標(biāo)記3﹑免疫定位分析25第25頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1﹑免疫沉淀

由于抗體與相應(yīng)的抗原兩者之間有特異性結(jié)合，在體外當(dāng)兩者濃度比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)。

原理：抗原抗體結(jié)合形成網(wǎng)絡(luò)而沉淀。

應(yīng)用：抗原或抗體的定性及定量分析。方法：①溶液中的沉淀反應(yīng)

②凝膠擴(kuò)散沉淀

③免疫電泳返26第26頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

①溶液中的沉淀反應(yīng)：液相中的沉淀線不易觀察，利用抗原抗體溶液之間的界面形成的沉淀線即環(huán)狀沉淀試驗(yàn)。在幾支試管中加入等量的抗原，再加入遞減量的抗體，中性、37℃保溫1－2hr，可見(jiàn)環(huán)狀沉淀。返27第27頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

②凝膠擴(kuò)散沉淀

原理：抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，兩者在比例合適的一定擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線。

用途：測(cè)定抗原和抗體的相對(duì)濃度，比較不同抗原的特異性﹑純度和相互關(guān)系。

方法：?jiǎn)蜗驍U(kuò)散法和雙向擴(kuò)散法返瓊脂凝膠中混有Ab小孔中加有Ag沉淀環(huán)單向28第28頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三左右二孔抗原濃度相同，沉淀線融合右孔抗原濃度較低，沉淀線細(xì)并靠近抗原孔右孔抗原甚微，近抗原孔處只有一彎眉雙向：不同抗原濃度對(duì)沉淀線特征的影響繼續(xù)29第29頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三在抗原抗體多種體系中沉淀線的特征(一)在抗原孔內(nèi)有三種抗原成分，分別與相應(yīng)抗體形成3條沉淀線。由于反應(yīng)的特異性，線互不干擾，線的順序位置決定于抗原的性質(zhì)二孔內(nèi)抗原成分性質(zhì)完全不同，出現(xiàn)沉淀線交叉現(xiàn)象左孔內(nèi)含二種抗原成分，其中一種與右孔內(nèi)相同，出現(xiàn)一條融合線繼續(xù)30第30頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三左右二孔抗原性質(zhì)相同，但右孔濃度過(guò)大，產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物逐漸溶解的“假刺”現(xiàn)象在抗原抗體多種體系中沉淀線的特征(二)左右二孔抗原性質(zhì)大部分相同，沉淀線融合較多左右二孔抗原性質(zhì)部分相同，出現(xiàn)部分融合現(xiàn)象返31第31頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三抗血清電泳后在膠中間沿電泳方向開(kāi)一條槽

③免疫電泳：是利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同能被分離開(kāi)來(lái)的特性與免疫擴(kuò)散結(jié)合一起進(jìn)行分析的方法。繼續(xù)32第32頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三火箭電泳：?jiǎn)蜗嗝庖邤U(kuò)散與電泳結(jié)合的一種方法。繼續(xù)33第33頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三雙向免疫電泳返34第34頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

2﹑免疫標(biāo)記①放射免疫分析②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）③發(fā)光與熒光免疫分析④親和標(biāo)記免疫分析返35第35頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

①放射免疫分析

是用放射核素標(biāo)記抗原/抗體，通過(guò)放射自顯影(固相體系)或液相閃爍儀(液相反應(yīng)體系)來(lái)定量抗原/抗體。有：

直接法：是用標(biāo)記的抗原或抗體與抗體或抗原直接反應(yīng)形成復(fù)合物而進(jìn)行測(cè)定。

競(jìng)爭(zhēng)法：是利用放射標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體反應(yīng)，再以放射強(qiáng)度定量返36第36頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）162頁(yè)

是一種免疫酶技術(shù)，特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)在此進(jìn)行。方法有：

直接法、間接法、夾心法繼續(xù)37第37頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理返38第38頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三