第十四章基因重組與基因工程

第十四章

基因重組與基因工程第一頁，共四十一頁。基因重組：genomicrecombination重組DNA：recombinantDNA第二頁，共四十一頁。第一節(jié)、自然界的基因重組轉化：transformation整合：integration轉導：transduction轉位：transposition第三頁，共四十一頁。轉化轉化：由外來DNA引起生物類型改變的過程稱為轉化。細菌的轉化第四頁，共四十一頁。轉化病毒癌基因感染宿主細胞后，可整合到宿主染色體上，從而使宿主細胞癌變。轉染：噬菌體感染宿主菌后，核酸進入菌體內的過程。細胞的轉化第五頁，共四十一頁。整合整合：

噬菌體感染大腸桿菌的第一步噬菌體粘附于細胞壁上，將自身的DNA注入菌體中。此DNA可與細菌染色體重組，成為細菌染色體的一部分。溶原菌：整合了噬菌體基因組的細菌。裂解：噬菌體感染大腸桿菌的第二步DNA利用菌體的酶系統，復制自身及外殼蛋白，組裝成大量新噬菌體，并將細菌漲破。第六頁，共四十一頁。整合溶原和裂解可以相互轉變。第七頁，共四十一頁。轉導溶原菌中DNA可以原樣地切離出來，也可以把鄰近的宿主DNA在切離時帶走一部分。后者稱轉導。帶有宿主DNA的噬菌體稱轉導噬菌體。來源于宿主的基因稱轉導基因。第八頁，共四十一頁。轉位轉位：一個或一組基因從一處轉到基因組的另一個位置。這些游動的基因稱為轉位子(transposon)。第九頁，共四十一頁。轉位第十頁，共四十一頁。第二節(jié)、基因工程基因工程：是用分離純化或人工合成的DNA在體外與載體DNA結合，成為重組DNA，用以轉化宿主，篩選出能表達重組DNA的活細胞，加以純化、傳代、擴增，成為克隆。也叫基因克隆或重組DNA技術。分子水平上操作，細胞水平上表達。賦予重組DNA以新的生命力。第十一頁，共四十一頁。基因工程腫瘤細胞的轉移與細胞表面的糖鏈類型有關，而后者又與糖基轉移酶的表達相關。已經證實GnT-Ⅴ與轉移有關。轉入GnT-Ⅴ基因肝癌細胞株SMMC7721觀察其遷移、侵襲、粘附等生物學行為轉入反義GnT-Ⅴ基因轉移轉移第十二頁，共四十一頁。基因克隆分切接轉篩第十三頁，共四十一頁。載體和目的基因載體：vector在宿主細胞內可獨立復制的完整DNA分子。但必須利用宿主的酶系統，才能有進一步的基因表達能力。常用的載體有：質粒、噬菌體、M13噬菌體逆轉錄病毒DNA、昆蟲病毒DNA載體與宿主共培育可大量生成，經純化后可用于基因工程。第十四頁，共四十一頁。質粒質粒：plasmid環(huán)形雙鏈DNA，大小約為數千堿基對，存在于大多數細菌的胞質中?？截悢担好總€細菌能容納的質粒數目。質粒的性質：易于從一個細菌轉移入另一個細菌。有兩三個抗藥性基因。有一個限制性內切酶切口。第十五頁，共四十一頁。質粒pBR322：常用的質粒第十六頁，共四十一頁。噬菌體載體噬菌體、M13噬菌體易于感染大腸桿菌噬菌體DNA比質粒大，對限制性內切酶有不止一個切口，需經過改造。一個切口：插入型載體。二個切口：置換型載體。第十七頁，共四十一頁。噬菌體載體第十八頁，共四十一頁。目的基因的來源直接從染色體DNA中分離：原核生物人工合成：簡單的多肽從mRNA合成cDNA：真核生物基因文庫：(genelibrary）G文庫：用基因組的全部DNA制備。c文庫：用細胞的全部mRNA制備出全套cDNA后建庫。第十九頁，共四十一頁。從mRNA合成cDNA第二十頁，共四十一頁。限制性內切酶的應用限制性內切酶可辨認4~6個核苷酸：回文結構回文結構：palindromeDNA雙鏈具有方向相反順序一致的結構。平端：bluntend在同一水平上切斷兩條鏈。(鈍型末端)粘性末端：stickyend堿基序列被酶以錯開幾個核苷酸的形式切開。第二十一頁，共四十一頁。限制性內切酶的應用AluI….AGCT…..….AGCT...

平端

…..TCGA…..….TCGA...

BamHI…GGATCC…...GGATTC…粘性...CCTAGG……CCTAAGG…末端

第二十二頁，共四十一頁。限制性內切酶的應用切載體切目的基因限制性內切酶相同粘性末端兩者相連要點：避免切斷目的基因第二十三頁，共四十一頁。載體和目的基因的連接人工連接器：linker人工合成的寡核苷酸，安置有限制性內切酶的識別序列。DNA連接酶：可用于連接堿基互補的二段核酸鏈。連接方式：粘端連接方式

尾接法第二十四頁，共四十一頁。粘端連接第二十五頁，共四十一頁。尾接法第二十六頁，共四十一頁。重組體的轉化基因的轉移：重組體進入宿主細胞的過程，已開發(fā)了很多方法?；瘜W法：CaCl2轉移法、堿金屬離子轉移法物理法：顯微注射法、基因槍法、電穿孔法生物學法：逆轉錄病毒載體、腺病毒載體第二十七頁，共四十一頁。重組體的轉化轉化：重組載體導入宿主后，利用宿主的酶系統表達的過程。即改變宿主性狀的過程。第二十八頁，共四十一頁?；蚬こ痰谋磉_體系的發(fā)展第二十九頁，共四十一頁。DNA重組體的篩選與鑒定根據重組載體的表型進行篩選：如質粒的抗藥性、營養(yǎng)素的依賴型DNA限制酶切圖譜分析：提取經粗選后的宿主DNA，用限制性內切酶切割后與原來載體比較。利用核酸雜交和放射自顯影進行鑒定：用目的基因作探針監(jiān)測宿主DNA是否重組體。第三十頁，共四十一頁。DNA重組體的篩選與鑒定滅活法篩選重組體。第三十一頁，共四十一頁。提取轉化細胞DNA限制性內切酶瓊脂糖凝膠電泳與原來載體及重組體比較DNA重組體的篩選與鑒定第三十二頁，共四十一頁。DNA重組體的篩選與鑒定菌落硝酸纖維素濾膜探針X線底片顯影平板第三十三頁，共四十一頁?；蚬こ滩呗缘谌捻?，共四十一頁。第三節(jié)、基因工程的應用生命科學研究趨勢基因診斷和基因治療基因工程產品的開發(fā)和應用第三十五頁，共四十一頁。生命科學研究趨勢基因的結構與功能研究基因表達的調控各種生物大分子之間的識別及結合了解生命的奧秘第三十六頁，共四十一頁?；蛟\斷和基因治療第三十七頁，共四十一頁?；蚬こ坍a品的開發(fā)和應用基因工程疫苗：安全廉價乙肝疫苗、甲肝疫苗巨細胞病毒、流行性出血熱、輪狀病毒、基因工程生產激素類：胰島素、生長激素細胞因子：生長因子、腫瘤壞死因子、造血因子、干擾素第三十八頁，共四十一頁。第五節(jié)、聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應：PCRpolymerasechainreaction耐熱細菌：DNA聚合酶能耐高溫，在70~80℃有很高的催化力。原理：以目的DNA為模板，快速合成大量的DNA，用于檢測、制備、研究。第三十九頁，共四十一頁。第五節(jié)、聚合酶鏈反應變性：95℃、15s引物粘合：55℃、30s引物延伸：72℃、1.5m第四十頁，共四十一頁。內容總結第十四章

基因重組與基因工程。重組DNA：recombinantDNA。轉化：由外來DNA引起生物類型改變的過程稱為轉化。此DNA可與細菌染色體重組，成為細菌染色體的一部分。溶原菌中DNA可以原樣地切離