病毒的分子生物學(xué)

病毒的分子生物學(xué)第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.1病毒分子生物學(xué)研究的內(nèi)容

病毒分子生物學(xué)是用現(xiàn)代分子生物學(xué)的新理論、新技術(shù)和新方法對(duì)病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能，基因組的復(fù)制、表達(dá)和調(diào)控，病毒與宿主的相互作用關(guān)系等進(jìn)行研究的一門學(xué)科。

第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二人類對(duì)病毒的研究成果在現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展史上，做出了重大的貢獻(xiàn)。許多分子生物學(xué)上的重大突破都是以病毒作為模式或研究材料而進(jìn)行的。

第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二其研究成果除了揭示許多重要的分子生物學(xué)過程之外，對(duì)人類認(rèn)識(shí)病毒感染、致病的分子本質(zhì)，為病毒引起疾病的診斷、預(yù)防和治療提供了理論基礎(chǔ)，促進(jìn)了基因工程疫苗和抗病毒藥物的研制和發(fā)展。

第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二病毒分子生物學(xué)研究領(lǐng)域12.1.1病毒基因組的結(jié)構(gòu)12.1.2病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)調(diào)控12.1.3病毒對(duì)宿主細(xì)胞的影響12.1.4病毒與腫瘤發(fā)生12.1.5病毒的基因工程疫苗與病毒載體第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.1.1病毒基因組的結(jié)構(gòu)不同類型的病毒，其基因組有很大差異。在核酸類型上，有DNA病毒(如腺病毒)，有RNA病毒(如反轉(zhuǎn)錄病毒)，但對(duì)每一種病毒來說，它只能含有一種核酸。第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二從核酸結(jié)構(gòu)上看，有的是單鏈核酸，有的是雙鏈核酸，有的是線狀，有的是環(huán)狀。一些單鏈RNA病毒的基因組還具有不同的極性，有的是正鏈RNA，有的是負(fù)鏈RNA。

第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二有的正鏈RNA病毒基因組5′端有帽子結(jié)構(gòu)，也有的正鏈RNA病毒基因組3′端有poly(A)尾結(jié)構(gòu)。

第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二相對(duì)于能獨(dú)立生活的微生物來說，病毒的基因組非常簡(jiǎn)單。病毒核酸的相對(duì)分子質(zhì)量約為1.6×107～1.6×108，僅為一般細(xì)菌基因組的1‰～l/10。

第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.1.2病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)調(diào)控病毒進(jìn)入活的易感宿主細(xì)胞后，借助于宿主細(xì)胞本身提供的原料、能量、酶等，以自我復(fù)制的方式進(jìn)行繁殖。第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二病毒基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過程。正鏈RNA病毒的基因組除了作為模板復(fù)制出子代RNA之外，還有mRNA的作用。作為翻譯的模板，一般先翻譯出單一的大分子肽鏈，然后再由蛋白酶降解為不同功能的結(jié)構(gòu)蛋白等。

第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二負(fù)鏈RNA病毒的基因組無mRNA的功能，必須由復(fù)制出的互補(bǔ)RNA(cRNA)來發(fā)揮mRNA的作用。

第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.1.3病毒對(duì)宿主細(xì)胞的影響病毒只能在活細(xì)胞中存活，因此，病毒與宿主細(xì)胞之間有著十分密切的關(guān)系。病毒利用宿主細(xì)胞的細(xì)胞器、能量和酶等進(jìn)行自身的復(fù)制，并通過宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)自身所需的蛋白質(zhì)，這些過程都將會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞的形態(tài)和功能產(chǎn)生重大的影響。

第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二病毒對(duì)宿主細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在病毒對(duì)宿主細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響以及病毒對(duì)宿主細(xì)胞功能的影響兩個(gè)方面。

第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.1.4病毒與腫瘤發(fā)生人類和動(dòng)物腫瘤的形成除了與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)外，某些DNA和RNA病毒也可以通過不同的機(jī)制誘發(fā)惡性腫瘤。有些病毒直接作用于細(xì)胞的基因組，使細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致腫瘤形成；有些病毒則通過抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，形成腫瘤。第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二有些病毒常伴隨一些特定腫瘤的發(fā)生，但它們與腫瘤的關(guān)系還未得到確認(rèn).例如在艾滋病病人中引發(fā)的Kaposi‘s肉瘤?？傊?，大約15%的惡性腫瘤與病毒有關(guān)，因此研究腫瘤的病毒病因具有十分重要的意義。第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.1.5病毒基因工程疫苗與病毒載體基因工程疫苗是指用基因工程的方法，表達(dá)病原微生物的一段基因序列，將表達(dá)產(chǎn)物(多數(shù)是無毒性、無感染能力，但具有較強(qiáng)的免疫原性)用作疫苗，例如正在使用的大多數(shù)乙型肝炎疫苗就是基因工程疫苗。第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二常見的基因工程疫苗包括亞基疫苗和肽疫苗兩類。以流感疫苗為例，其途徑就是把病毒的免疫原蛋白(HA抗原、NA抗原)的mRNA提取出來，再制備cDNA,克隆到大腸桿菌中，高效表達(dá)該抗原。

第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二由于基因工程疫苗具有安全性好、產(chǎn)量高、成本低，以及良好的免疫原性，它必將成為傳統(tǒng)疫苗的有效替代疫苗。

第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2DNA病毒的分子生物學(xué)DNA病毒基因組有單鏈和雙鏈兩種結(jié)構(gòu)，并以線狀或環(huán)狀形式存在，大部分為單一分子，也有的由數(shù)個(gè)片段的DNA分子構(gòu)成分段的基因組。

第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二動(dòng)物DNA病毒多為雙鏈DNA基因組，腺病毒、痘病毒、皰疹病毒都是雙鏈線狀DNA基因組，末端有重復(fù)序列，經(jīng)退火能形成環(huán)形分子。腺病毒(Aflenovirus)是一種典型的雙鏈DNA病毒，下面以腺病毒的基因表達(dá)調(diào)控為例，簡(jiǎn)要介紹DNA病毒的分子生物學(xué)。

第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2.1腺病毒的發(fā)現(xiàn)1953年，Rowe等人從外科手術(shù)摘除的兒童腺體中分離到一種致病因子，可以使培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生慢性進(jìn)行性病變，稱之為腺體退化因子，后來證明這種致病因子是病毒，1956年，Enders等建議命名為腺病毒。

第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二腺病毒分布十分廣泛，從各種胎生哺乳動(dòng)物、鳥類和兩棲類動(dòng)物中都已分離到。腺病毒科分兩個(gè)屬：1、哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)2、禽腺病毒屬(Ariadenovirus)。

第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二腺病毒感染細(xì)胞后可關(guān)閉宿主細(xì)胞某些基因的表達(dá)，大量合成病毒蛋白質(zhì)，致使細(xì)胞的功能失常。腺病毒致癌的分子機(jī)理是目前分子病毒學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。

第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2.2腺病毒的毒粒結(jié)構(gòu)

完整的腺病毒顆粒其相對(duì)分子質(zhì)量1.7×108-1.85×108，沉降常數(shù)約560S，在CsCl中的密度為1.32～1.35g/cm3。腺病毒對(duì)熱和酸穩(wěn)定，能在腸道中存活。腺病毒顆粒無包膜，外邊是蛋白外殼，中間為緊密的核心顆粒，內(nèi)含單一拷貝的雙鏈DNA。

第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2.3腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)

腺病毒基因組為線形雙鏈DNA，人類腺病毒基因組包括早期基因E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4以及晚期基因L1、L2、L3、L4和L5。

第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2.4腺病毒的復(fù)制

第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2.5腺病毒的基因轉(zhuǎn)錄

第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2.6腺病毒與腫瘤至今尚未發(fā)現(xiàn)腺病毒感染與任何人類腫瘤的關(guān)系。但許多的人類腺病毒卻可以使嚙齒動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或使這些動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤。

第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.2.7腺病毒作為基因治療的載體

腺病毒用作基因治療載體和疫苗研制有著廣闊的前景。腺病毒基因組的E1區(qū)和E3區(qū)可以作為外源基因的插入?yún)^(qū)。E1區(qū)缺失的腺病毒可克隆約4.7kb的外源DNA，而E3區(qū)缺失的腺病毒可以克隆約8kb的外源DNA，一些特定的腺病毒株已被用于人類疫苗的研制。

第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二腺病毒作為基因治療載體有著以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)：(1)腺病毒基因組研究的比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作。(2)其感染一般不引起明顯的癥狀，與宿主染色體整合的機(jī)率很低，作為基因治療的載體比較安全。

第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二(3)可以感染不同類型細(xì)胞，易于進(jìn)行體外培養(yǎng)，病毒感染細(xì)胞滴度高，可在細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制。(4)腺病毒感染細(xì)胞后可以高水平的表達(dá)蛋白，在感染后期，宿主基因表達(dá)被關(guān)閉，易于高水平表達(dá)外源基因。

第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.3RNA病毒的分子生物學(xué)

RNA病毒基因組均呈線狀，有單雙鏈之分，有單一分子，也有的基因組是分段的。RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)病毒基因表達(dá)調(diào)控有重要影響。

第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二下面介紹一種典型的RNA病毒，黃病毒科丙型肝炎病毒屬的成員——丙型肝炎病毒(HCV)。

第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.3.1HCV的發(fā)現(xiàn)

丙型肝炎病毒HCV(hepatitisCvirus)是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行研究的成功實(shí)例。

第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.3.2HCV基因組的結(jié)構(gòu)與功能

HCV是有外膜的單正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)約l0000nt。HCV僅有一個(gè)幾乎為全基因組長(zhǎng)度的翻譯可讀框ORF，編碼3010~3033個(gè)AA的多聚蛋白，經(jīng)過蛋白酶加工，切割成結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。許多黑猩猩和人類HCV毒株已被完全測(cè)序。

第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.3.3HCV基因組的復(fù)制

第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.4反轉(zhuǎn)錄病毒的分子生物學(xué)反轉(zhuǎn)錄病毒基因組是線形正鏈RNA,正鏈RNA沒有mRNA活性，需要在自身的反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將正鏈RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，通過向宿主細(xì)胞基因組的整合，在宿主細(xì)胞RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄出mRNA。

第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二人類免疫缺陷病毒(HIV)是最典型也是最重要的反轉(zhuǎn)錄病毒。以下簡(jiǎn)要介紹HIV的分子生物學(xué)。

第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.4.1艾滋病與HIV

艾滋病是一種導(dǎo)致以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病，人類免疫缺陷病毒(HIV)是其病原體，感染者終生攜帶病毒，目前缺乏有效的治療手段。

第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.4.2病毒的結(jié)構(gòu)與生活周期

HIV顆粒呈球形，直徑約110nm,HIV顆?？煞譃榘ぁ⒁職ず筒《竞诵娜糠?。核心內(nèi)部是兩個(gè)長(zhǎng)度為9.2kb的單股正鏈RNA，核心外側(cè)為脂質(zhì)雙層組成的外膜，膜上有穿膜蛋白gp41和外膜蛋白gpl20。

第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二HIV的生活周期包括以下階段：①吸附，②侵入和脫殼，③反轉(zhuǎn)錄，④整合，⑤病毒RNA和蛋白質(zhì)的合成，⑥裝配，⑦釋放，⑧成熟。

第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.4.3病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能

人免疫缺陷病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，分HIV-1型和HIV-2型。

第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二HIV基因組兩個(gè)相同的正鏈RNA每條鏈均包含了HIV結(jié)構(gòu)與功能所需的遺傳信息，兩條RNA單鏈被核衣殼蛋白所包裹，并通過其5′端非共價(jià)結(jié)合，形成二聚體。

第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二在HIV基因組RNA的5′端具有帽子結(jié)構(gòu)，3′端有poly(A)尾巴，在反轉(zhuǎn)錄并整合后所形成的前病毒cDNA的兩端，為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)。LTR具有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的雙重功能。第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二HIV基因組長(zhǎng)約9.2kb。能編碼至少17種蛋白質(zhì)，除具有與其他反轉(zhuǎn)錄病毒相似的gag、pot和env基因外，還可編碼多種調(diào)節(jié)蛋白，因此HIV又被稱為復(fù)雜性反轉(zhuǎn)錄病毒。這些基因的排列十分緊湊，部分區(qū)域有重疊，除少數(shù)為斷裂基因外，多數(shù)基因是連續(xù)的。

第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二在HIV基因組中，有三個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶的基因，分別稱為gag、pol和env，其中g(shù)ag與pol使用不同的閱讀框架，并有部分重疊。此外，還包括6個(gè)編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因。

第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.4.4HIV基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)

在宿主體內(nèi)，病毒基因的表達(dá)及調(diào)節(jié)是病毒與細(xì)胞相互作用的集中體現(xiàn)。與那些簡(jiǎn)單的反轉(zhuǎn)錄病毒相比，HIV具有更完善的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二一方面可以直接利用宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制，另一方面又能編碼自身的調(diào)節(jié)蛋白。宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和病毒調(diào)節(jié)蛋白在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯和翻譯后修飾等各個(gè)環(huán)節(jié)中都能發(fā)揮重要的作用。第49頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二而宿主以及與HIV共感染的其他病毒，也能借助于細(xì)胞因子和病毒基因產(chǎn)物來調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)。由此形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，可以精細(xì)地調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的啟動(dòng)、關(guān)閉及其速率，按照既定程序完成病毒復(fù)制的過程。第50頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二與真核細(xì)胞基因表達(dá)過程相對(duì)應(yīng)的是，HIV基因表達(dá)的調(diào)節(jié)表現(xiàn)為多級(jí)調(diào)控系統(tǒng)，存在著多個(gè)調(diào)控點(diǎn)，可大體劃分為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)、翻譯水平調(diào)節(jié)和翻譯后水平的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，是HIV調(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要環(huán)節(jié)。

第51頁，共56頁，2023年，2月20日，星期二12.4.5病毒基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控

HIVmRNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)是在病毒基因產(chǎn)物和細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用下完成的。HIV可以通過它的加帽位點(diǎn)和poly(A)信號(hào)完成mRNA的加帽和加