第八章外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

一、重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類(lèi)型多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用合適分離純化介質(zhì)的選擇分離純化過(guò)程的規(guī)?；壳耙豁?yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)1.針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略采用分泌型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理；采用包涵體型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體；采用融合型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進(jìn)行純化

表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。目前二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)2.針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類(lèi)型

等電點(diǎn)處于極端區(qū)域（pI≤5

或pI≥8）的重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進(jìn)行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親合層析

疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進(jìn)行分離的；

凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進(jìn)行分離的；目前三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)3.多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用在選擇分離純化方法時(shí)應(yīng)遵循下列原則：應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法應(yīng)盡量選擇高效的分離方法應(yīng)將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法安排在最后階段目前四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)4.合適分離純化介質(zhì)的選擇常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Superose。理想的分離純化介質(zhì)應(yīng)具有下列性質(zhì)：對(duì)目標(biāo)蛋白具有較高的分離效率對(duì)目標(biāo)蛋白不會(huì)造成變性化學(xué)性能和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好價(jià)格低廉目前五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)Sephadex

是由葡聚糖通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒Superose是在珠狀瓊脂糖顆粒的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)兩次交聯(lián)后得到的目前六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)5.分離純化過(guò)程的規(guī)?；鞍踪|(zhì)分離純化的實(shí)驗(yàn)室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過(guò)程未必合適，如：實(shí)驗(yàn)室方法在工程上可能難以實(shí)現(xiàn)（超聲波破細(xì)胞壁）實(shí)驗(yàn)室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過(guò)高（超速離心）因此，在很多情況下，實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。目前七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)1.離子交換層析二、常用的分離方法離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換層析的基本操作離子交換介質(zhì)的選擇原則目前八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換層析的基本原理離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對(duì)待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物進(jìn)行分離的層析技術(shù)。目前九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換劑亦稱(chēng)離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物如樹(shù)脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；

離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中的其它陽(yáng)離子交換劑的基本性能離子或陰離子起交換作用不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的成分逐個(gè)洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的目前十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)

陰離子交換劑：強(qiáng)堿型和弱堿型離子交換劑的分類(lèi)

陽(yáng)離子交換劑：強(qiáng)酸型和弱酸型目前十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)陽(yáng)離子交換劑

分為強(qiáng)酸型、中強(qiáng)酸型和弱酸型三類(lèi)，強(qiáng)酸型含有－R－SO3H，中強(qiáng)酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型含有－COOH或－OH。

陽(yáng)離子交換進(jìn)行的反應(yīng)如下：目前十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)陰離子交換劑

分為強(qiáng)堿型、中強(qiáng)堿型和弱堿型三類(lèi)，含有四級(jí)銨鹽[－N+(CH3)3]為強(qiáng)堿型，三級(jí)以下銨鹽[－N(CH3)2]、[－NHCH3]、[－NH2]都屬弱堿型；同時(shí)具有強(qiáng)堿和弱堿型基團(tuán)的，為中強(qiáng)堿型。

陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行的反應(yīng)如下：

目前十三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)強(qiáng)離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽(yáng)離子交換劑在pH值降低時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱目前十四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)常用的離子交換劑離子交換樹(shù)脂：最常見(jiàn)的離子交換樹(shù)脂是含有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物離子交換樹(shù)脂的優(yōu)點(diǎn)是：流速快，對(duì)小分子物質(zhì)的交換容量大，因而適合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物質(zhì)的分離純化目前十五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換纖維素：

離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過(guò)，因而對(duì)生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹(shù)脂大

陽(yáng)離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等維素）

陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖目前十六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換葡聚糖：離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并帶有離子交換功能基團(tuán)。Sephadex的優(yōu)點(diǎn)如下：親水性強(qiáng)、不會(huì)引起生物分子的變性和失活，母鏈對(duì)蛋白質(zhì)、核酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小電離基團(tuán)在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng)因而Sephadex是一類(lèi)廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì)目前十七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)

常用的離子交換葡聚糖包括：陽(yáng)離子交換劑

CM-SephadexC-25，CM-SephadexC-50陰離子交換劑 DEAE-SephadexA-25，DEAE-SephadexA-50

QAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-50

目前十八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換瓊脂糖：

離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團(tuán)的SepharoseCL-6B尤其是介質(zhì)受pH和離子強(qiáng)度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)此具有穩(wěn)定的外形體積目前十九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換介質(zhì)的選擇原則一般而言：酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化堿性物質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑分離曲線來(lái)選擇目前二十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽(yáng)離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）對(duì)pI=5的某酸性蛋白質(zhì)在pH的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)，應(yīng)首選DEAE纖維素；在pH的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽(yáng)離子時(shí)，應(yīng)首選CM纖維素目前二十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換層析的基本操作(1)層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要目的：保證待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定；使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合；使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。目前二十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)(2)樣品進(jìn)柱為了達(dá)到滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20%為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過(guò)高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù)目前二十三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)離子交換層析的基本操作(3)樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090分子濃度離子強(qiáng)度pH值目前二十四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度目前二十五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)時(shí)刻要記?。旱鞍踪|(zhì)是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質(zhì)也存在等電點(diǎn)（pI），蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀況同氨基酸相同，取決于所處溶液的pH

值。當(dāng)pI<pH時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；而當(dāng)

pI>pH時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。舉一例子：已知蛋白X等電點(diǎn)為7，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)利用陰離子交換樹(shù)脂純化。答案：建立陰離子交換柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的緩沖液平衡柱子，同時(shí)蛋白X溶解于pH8.5的緩沖液中，在此pH值下蛋白X帶有負(fù)電，將含有蛋白X的混合液上樣，然后用起始液沖洗，蛋白X會(huì)與此柱結(jié)合，然后鹽梯度洗脫。目前二十六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)2.凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠層析的基本操作凝膠介質(zhì)的選用原則目前二十七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)凝膠層析的基本原理凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對(duì)混合物中各組份按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)，又稱(chēng)為分子篩。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會(huì)被全部排阻在凝膠顆粒之外，即全排阻；鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測(cè)定以及分離純化。目前二十八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)凝膠過(guò)濾的作用機(jī)制目前二十九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖目前三十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠目前三十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前三十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前三十三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前三十四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前三十五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)葡聚糖凝膠的種類(lèi)有G10、G15、G25、G50、G75、G100

葡聚糖凝膠對(duì)堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110℃，干的則能耐受120℃高溫葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠G10＜700

葡聚糖凝膠G15＜1500

葡聚糖凝膠G251000-5000

葡聚糖凝膠G501000-30,000目前三十六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)

瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來(lái)的天然凝膠，常見(jiàn)的有Sepharose（Sepharose2B、4B、6B）。瓊脂糖凝膠

當(dāng)溫度高于50℃時(shí)瓊脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。目前三十七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)

聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號(hào)從P-2至P-300共10種聚丙烯酰胺凝膠目前三十八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)凝膠介質(zhì)的選用原則將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開(kāi)，稱(chēng)為組別分離，其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。

組別分離一般選用SephadexG-25或G-50，對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用SephadexG-10、G-組別分離15、Bio-GelP-2或P-4目前三十九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開(kāi)，這種分離叫分級(jí)分離

分級(jí)分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠。在層析過(guò)程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由分級(jí)分離于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。目前四十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)凝膠層析的基本操作平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時(shí)需要的流速注意凝膠的斷層和氣泡層析柱平衡操作壓控制平衡和洗脫時(shí)應(yīng)維持流速恒定目前四十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來(lái)確定：進(jìn)樣體積進(jìn)行組別分離時(shí)，樣品溶液最大可為柱體積的10%進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)，樣品溶液的體積要小，使樣品層盡可能窄，這樣洗脫出的峰形好目前四十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)3.親和層析親和層析的基本概念親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析配基的性質(zhì)與選擇親和層析的基本操作目前四十三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)親和層析的基本概念

親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配體之間特異性的親和力進(jìn)行分離的一類(lèi)特殊的層析技術(shù)，它有如下特點(diǎn)：純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子親和層析的基本特點(diǎn)純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專(zhuān)一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件因此應(yīng)用范圍受到一定的限制目前四十四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)抗原與抗體DNA與互補(bǔ)DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶與其底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、輔酶因子激素或藥物與其受體具有特異性親和作用的生物分子維生素于其特異性結(jié)合蛋白糖蛋白與其相應(yīng)的植物凝集素目前四十五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑當(dāng)含有混合組份的樣品（流動(dòng)相）通過(guò)此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)親和層析的基本原理合，其它沒(méi)有親和力的無(wú)關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出然后改變流動(dòng)相成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái)目前四十六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)親和層析（affiuitychromatography）

應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a.理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、

sepharose、sephadex目前四十七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)親和層析原理示意圖

蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)加入的可溶性配基專(zhuān)一性結(jié)合蛋白質(zhì)沒(méi)有結(jié)合的蛋白質(zhì)非專(zhuān)一性結(jié)合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度洗脫體積與配體專(zhuān)一性結(jié)合蛋白質(zhì)加入配基基質(zhì)目前四十八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)親和層析載體的性質(zhì)與選擇具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過(guò)具有良好機(jī)械性能的均勻珠狀顆粒，具有良好的流速親和層析載體的選擇具有惰性，盡量減少非專(zhuān)一性吸附具有相當(dāng)量的易活化的基團(tuán)，在溫和的條件下能與配基共價(jià)合偶聯(lián)在偶聯(lián)、吸附和洗脫時(shí)，有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性目前四十九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)纖維素葡聚糖凝膠常用的親和層析載體瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體

目前五十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)純化對(duì)象和配基之間必須有較強(qiáng)的親和力但親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x配基復(fù)合物時(shí)所需的親和層析配基的選擇條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使生物分子變性配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配基與生物分子之間特異結(jié)合，但可用于和載體相連，同時(shí)又不影響配基與生物分子之間的親和力目前五十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)酸酐法N-取代羥基琥珀酰亞胺法配基的偶聯(lián)疊氮化作用還原性烷基化合物（西夫堿）的形成目前五十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)親和層析的基本操作通常采用改變pH、離子強(qiáng)度、離子種類(lèi)或者溫度等，降低其親和力。非專(zhuān)一性洗脫化的配基對(duì)相應(yīng)的生物大分子的親和力降低非專(zhuān)一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，而是洗脫劑中的某一組分與固定配基形成復(fù)合物，使固定目前五十三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)使用特異的配基作為洗脫劑溶液為洗脫劑，通過(guò)與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)洗專(zhuān)一性洗脫使用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物脫目標(biāo)產(chǎn)物目前五十四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)親和雙方吸附能力很強(qiáng)，可以用專(zhuān)一的化學(xué)方法裂解配基與載特殊性洗脫體的連接鍵，獲得的配基-蛋白絡(luò)合物后，再除去配基。目前五十五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)4.膜分離膜分離的基本原理分離膜的主要性能影響膜分離的因素目前五十六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)膜分離的基本原理膜分離是利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在一定量的能量差作為膜分離的基本定義推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)的分離。依據(jù)濾膜孔徑和物質(zhì)粒子的大小而達(dá)到物質(zhì)分離的目的目前五十七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)分離效率高膜分離的特點(diǎn)不涉及相變，能耗低，運(yùn)行成本低膜分離為單純物理變化，無(wú)二次污染目前五十八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)分離膜的選擇通透性：是物質(zhì)分離的第一機(jī)制膜分離過(guò)程的重要參數(shù)膜分離過(guò)程的推動(dòng)力：靜壓力差、濃度差、電位差物質(zhì)通過(guò)分離膜的速度：是物質(zhì)分離的第二機(jī)制目前五十九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)根據(jù)分離膜膜內(nèi)平均孔徑、推動(dòng)力和傳遞機(jī)制不同，膜分離可膜分離的主要類(lèi)型反滲透（ReverseosmosisRO）透析（DialysisDS）分成下列幾類(lèi)：超濾（UitrfiltrationUF）微濾（MicrofitrationMF）電滲析（ElectrodialysisEI）目前六十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)透析半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽單糖等分開(kāi)。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料目前六十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)按照分子大小進(jìn)行分離。分離取決于透析袋截留的分子量。透析液濃縮的蛋白混合樣品透析袋開(kāi)始透析處于平衡狀態(tài)目前六十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)反滲透（ReverseosmosisRO）

反滲透其主要原理是在高于溶液滲透壓的作用下，使其它物質(zhì)溶解鹽類(lèi)、膠體、微生物、熱源、有機(jī)物等，因而主要用于海水、不能透過(guò)半透膜，而將這些物質(zhì)與水分離開(kāi)來(lái)，有效地去除水中的苦咸水淡化和產(chǎn)純水制備等方面目前六十三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)超濾（UitrfiltrationUF）

超濾是一種根據(jù)高分子溶質(zhì)之間或高分子與小分子溶質(zhì)之間相相應(yīng)的截留分子量范圍從500到100萬(wàn)左右。對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的方法。篩分孔徑范圍1nm-0.1mm，目前六十四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)超濾目前六十五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)分離膜的基本性能

分離膜是膜分離技術(shù)的核心，分離膜的性能主要包括分離透過(guò)性、耐酸堿性、抗氧化性、抗微生物降解性、親水性、疏水性、電性能和化學(xué)物理性能兩部分。其中，化學(xué)物理性能主要涉及到耐熱性能、毒性、機(jī)械強(qiáng)度等。膜的化學(xué)物理性能目前六十六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)微濾膜 0.025-14mm反滲透膜 0.0001-0.001mm超濾膜 0.001-0.02mm納米過(guò)濾膜 平均孔徑2nm膜的分類(lèi)按膜的孔徑大小分類(lèi)：目前六十七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)對(duì)稱(chēng)性膜 膜截面上的孔道結(jié)構(gòu)均勻不對(duì)稱(chēng)性膜 由表面活性層（超薄層）和惰性層（支撐層）構(gòu)成按膜的結(jié)構(gòu)分類(lèi)： 傳質(zhì)阻力大，透過(guò)通量低，易污染、難清洗 傳質(zhì)阻力小，透過(guò)通量高，被廣泛使用目前六十八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)天然高分子膜醋酸纖維素、硝酸纖維素、再生纖維素合成聚合物膜聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物按膜的材料分類(lèi)：無(wú)機(jī)材料膜陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼、碳素目前六十九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)影響膜分離的因素影響膜分離效率的主要因素是膜的污染，其表現(xiàn)形式是：溶質(zhì)在膜孔內(nèi)吸附造成膜污染的主要原因是：蛋白質(zhì)在不同pH條件下所帶電荷對(duì)膜電荷的相互作用無(wú)機(jī)鹽通過(guò)形成復(fù)合物、改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度等機(jī)制污染膜溶質(zhì)在膜表面沉淀或結(jié)晶膜分離過(guò)程中體系的粘度增大會(huì)污染膜目前七十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)

三、基因重組蛋白包涵體的分離和復(fù)性目前七十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式位于細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞周質(zhì)細(xì)胞外表達(dá)產(chǎn)物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白目前七十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá):

外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，常會(huì)發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。目前七十三頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)

在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集

簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作

包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白。目前七十四頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)

以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)

有效的變性復(fù)性操作，才能得到有正確空間構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。

體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過(guò)30%

復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。目前七十五頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)包涵體直徑約0.5-1μm，具有很高的密度（約1.3mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。目前七十六頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)包涵體加工流程離心去除細(xì)胞碎片（膜蛋白和脂類(lèi)等）機(jī)械破碎法包涵體提取如何對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行高效體外復(fù)性以獲得活性產(chǎn)品是生物工程產(chǎn)業(yè)化經(jīng)常面臨的一個(gè)難題目前七十七頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)包涵體的洗滌為除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體沉淀常用去污劑TritonX-l00或脫氧膽酸鈉和低濃度變性劑（如2mol/L尿素或鹽酸胍等，洗滌以除去脂類(lèi)和膜蛋白。如：50mMTris-HCl，，2M尿素，1mMEDTA目前七十八頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)包涵體的溶解大多數(shù)在pH8的條件下，用強(qiáng)變性劑如8mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展對(duì)于含有S-S的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵→為將包涵體充分溶解，需加入還原劑（如二硫蘇糖醇DTT、GSH、β－巰基乙醇β-ME）打開(kāi)蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，一般是50-100mMβ-ME或DTT（對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵的有時(shí)也應(yīng)使用還原劑，因?yàn)楹琒-S的雜蛋白會(huì)影響包涵體的溶解）同時(shí)還應(yīng)加入金屬螯合劑，如EDTA，用來(lái)螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子，防止已經(jīng)處于還原狀態(tài)的SH-與之發(fā)生氧化反應(yīng)。包涵體溶解后，蛋白質(zhì)成為失去了生物學(xué)活性伸展肽鏈

目前七十九頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)蛋白質(zhì)復(fù)性機(jī)理蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中，涉及兩種疏水相互作用：一是分子內(nèi)的疏水相互作用→促使蛋白質(zhì)正確折疊二是肽鏈分子間的疏水相互作用→導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集，形成寡聚體和多聚體→再進(jìn)一步聚集形成沉淀→兩者互相競(jìng)爭(zhēng)，影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率?！鷱?fù)性過(guò)程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復(fù)性收率的關(guān)鍵。伸展態(tài)U中間體I局部肽段先由氫鍵形成一些二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元，如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角等聚集體A天然態(tài)N快慢目前八十頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)一般說(shuō)來(lái)，在優(yōu)化的條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性效率在20%左右

目前八十一頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)復(fù)性常用方法1.稀釋復(fù)性：直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺點(diǎn)是體積增加較大，后續(xù)處理困難。目前八十二頁(yè)\總數(shù)九十四頁(yè)\編于十六點(diǎn)

2.透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度，速度慢，不適合大規(guī)模操作。

3.超濾復(fù)性：