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題目高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿中美羅培南的濃度方法學(xué)驗證目錄TOC\o"1-2"\h\u18100摘要 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿中美羅培南的濃度摘要建立一種簡單、快速、準確、靈敏度高且重現(xiàn)性好的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法來測定人血漿中美羅培南濃度的方法并驗證,為其臨床合理用藥提供依據(jù)。以法羅培南(Faropenem)為內(nèi)標,血漿樣品預(yù)處理采用沉淀蛋白法:以1mL乙腈沉淀蛋白,經(jīng)高速冷凍離心機離心后,取上清液進樣。色譜柱為UltimatePolar-RPHPLC3μm(3.0mm×100mm);流動相為0.2%甲酸(95%水:5%乙腈);流速為0.4mL/min;柱溫:40℃。結(jié)果美羅培南在0.1~40μg/mL的濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,R2=0.9998;定量下限為0.1μg/mL;高,中,低,LLOQ濃度點的美羅培南提取回收率相一致,均在15%左右,并且高,中,低,LLOQ4個濃度點的美羅培南提取回收率的RSD均小于15%,具有良好的精密度和重現(xiàn)性;日內(nèi)、日間RSD均小于15%。本方法操作簡單、快捷、準確、靈敏度高且重現(xiàn)性良好,適用于臨床上對美羅培南的血藥濃度的快速監(jiān)測。關(guān)鍵詞:高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;人血漿;美羅培南;血藥濃度DeterminationofMeropeneminHumanPlasmabyHPLC-MS/MSAbstract:Objective:Toestablishandoptimizeasimple,fast,accurate,high-sensitivityandreproduciblehighPerformanceliqiudchromatographymethodfordeterminingtheconcentrationofmeropeneminhumanplasmaforprovidingapracticalmethodforclinicaluseofmeropenem,andvalidatethemethodology.Methods:PlasmasampleswerespikedwithFaropenemastheinternalstandard,plasmawasprecipitatedwith1mLacetonitrile,aftermixedfor5mins,theywerecentrifugedwithhighspeedfreezingcentrifugeandthesupernatantwasinject.SeparationasachievedonanUltimatePolar-RPHPLC3μm(3.0mm×100mm).Themobilephasewas0.2%HF(95%H2O:5%ACN),andthepumpflowratewas0.4mL/min.Thecolumntemperaturewas40℃.Results:Calibrationcurvesofmeropenemshowedgoodlinearregressionintherangeof0.1~40μg/mL(R2=0.998)Thelowerlimitofquantificationofmeropenemwas0.1μg/mL.Theextractionrecoverybetweenthehigh,medium,lowandLLOQconcentrationofmeropeneminqualitycontrolsampleswasconsistentwitheachother,andwasaround15%.TheRSDofthefourconcentrationlevelQCsamplewaslessthan15%withgoodprecisionandreproducibility.Intra-andinter-dayvariationswere<15%.Conclusion:Theestablishedmethodsimple,fast,accurate,sensitiveandhasgood-reproduciblefortheclinicalbloodconcentrationofmeropenemfastmonitoring.KeyWords:LC-MS/MS;Meropenem;Theconcentrationofmeropeneminhumanplasma.引言美羅培南屬于廣譜碳青霉烯類抗生素,用于重癥感染,多用作為耐藥菌感染的最后選擇。臨床患者用藥后,個體間血藥濃度存在較大差異,故測定血藥濃度對臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。美羅培南的測定方法有多種,如氣相色譜法[1],旋光法[2],熒光共振能量轉(zhuǎn)移光譜法[3]等,而在臨床檢測中,HPLC法是測定美羅培南的人血藥濃度的常用分析手段。1.儀器與試藥1.1儀器BT125D電子天平(sartorius公司);移液槍(eppendorf公司);VortexGenius3渦旋混合器(德國IKA集團);NexeraX2LC-30AD液相色譜-API3200質(zhì)譜聯(lián)用儀,含DGU-20A在線脫氣單元、CTO-30A柱溫箱、SIL-/30A自動進樣器;色譜工作站Analyst1.6.2系統(tǒng)軟件(美國ABSCIEX公司);KDC-2044低速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);ThermoScientificMicro21R微量臺式離心機(美國Thermo公司)1.2試藥對照品:美羅培南標準品(EuropeanPharmacopoeiaReferenceStandard,歐洲藥典委員會)(批號:201403)試劑:乙腈(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司);法羅培南(批號:050401,江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司);甲酸(色譜純,上海久億化學(xué)試劑有限公司);哇哈哈純凈水(杭州哇哈哈集團有限公司)2.方法與結(jié)果2.1色譜條件柱溫:40℃進樣體積:2μL流速:0.4mL/min內(nèi)標:法羅培南色譜柱:UltimatePolar-RPHPLC色譜柱(3.0mm×100mm,3μm)流動相:乙腈(B):0.2%甲酸(A)梯度:時間(min)AB0.09551.09551.575255.535655.69558.09552.2質(zhì)譜條件Polarity:Postive;Scantype:MRM;CurtainCas(CUR):20;CollisionCas(AD):5;IonSprayVoltage(IS):5500;Temperture(TEM):500;IonSourceGas1(Gas1):50;IonSourceGas2(Gas2):50;InteerfaceHerter(ihe):OnQ1Mass(Da)Q3Mass(Da)Time(msec)DP(volts)CE(volts)384.20141.23002420308.0178.030050162.3溶液的配置2.3.1標準溶液的配制稱取取美羅培南(Meropenem130506-201403)約3mg用稀釋液(ACN:H2O=1:1)稀釋至1mg/mL,作為儲備液溶液,于4℃的條件下冰箱保存?zhèn)溆?。精密量取美羅培南標準儲備液,采用稀釋液定量稀釋,配制成質(zhì)量濃度從高到底依次為400,200,100,50,10,5,1μg/mL的美羅培南系列標準品溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。美羅培南系列標準溶液稀釋方法如下:1.400μg/mL標準溶液:儲備溶液400μL+稀釋液600μL→400μg/mL標準溶液2.200μg/mL標準溶液:400μg/mL標準溶液500μL+稀釋液500μL→200μg/mL標準溶液3.100μg/mL標準溶液:200μg/mL標準溶液500μL+稀釋液500μL→100μg/mL標準溶液4.50μg/mL標準溶液:100μg/mL標準溶液500μL+稀釋液500μL→50μg/mL標準溶液5.10μg/mL標準溶液:50μg/mL標準溶液200μL+稀釋液800μL→10μg/mL標準溶液6.5μg/mL標準溶液:10μg/mL標準溶液500μL+稀釋液500μL→5μg/mL標準溶液7.1μg/mL標準溶液:5μg/mL標準溶液200μL+稀釋液800μL→1μg/mL標準溶液2.3.2內(nèi)標溶液的配制采用十萬分之一天平精密稱取法羅培南適量,用稀釋液(ACN:H2O=1:1)溶解稀釋得1mg/mL的法羅培南內(nèi)標儲備液,冰箱保存?zhèn)溆?。精密量取?nèi)標儲備液適量用稀釋液定量稀釋,配制成200μg/mL的內(nèi)標溶液在4℃的條件下保存,現(xiàn)用現(xiàn)配。2.4血漿樣品預(yù)處理將血樣放入低速冷凍離心機離心8min,轉(zhuǎn)速調(diào)至3000r/min;拿出血樣后,用移液槍吸取上清液。取100μL上清液加入10μL法羅培南(200μg/mL)混勻,加入1mL乙腈渦旋混勻5min,離心5min后,取上清液2μL進HPLC。2.5方法專屬性(考察血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾)采用“2.1”項下的本實驗的色譜條件,考察空白血漿(6個不同個體的空白血漿和6個不同個體的空白血漿的混合血漿),空白血漿加入美羅培南標準品溶液及內(nèi)標溶液,以及給藥后臨床患者的血漿樣品色譜圖。圖1空白血漿圖2空白血漿+內(nèi)標圖3空白血漿+藥+內(nèi)標結(jié)論:美羅培南保留時間在3.39min左右,法羅培南保留時間在4.36左右,美羅培南和內(nèi)標法羅培南峰形良好,無雜峰干擾,基線平穩(wěn)。2.6標準曲線及定量下限取解凍后的空白血漿100μL,置于1.5mL的EP管中,分別精密加入400,200,100,50,10,5,1μg/mL的美羅培南標準品系列溶液各10μL于100μL空白血漿中,渦旋儀上混合均勻,使得血藥濃度相當(dāng)于40,20,10,5,1,0.5,0.1μg/mL,再加入10μL法羅培南(200μg/mL)混勻,按照“2.3血漿樣品預(yù)處理”項下方法同法處理后,進樣2μL,記錄色譜圖,記錄美羅培南與法羅培南的保留時間和峰面積,以美羅培南血漿濃度為橫坐標,美羅培南與內(nèi)標物法羅培南的峰面積之比為縱坐標,對美羅培南血藥濃度進行線性回歸,得到線性回歸方程。表1美羅培南的線性序號濃度峰面積(MMP)峰面積(FMP)10.11138.7126715.420.55359.9125609.63111302.3133014.74550123.8117984.3510105973.3118341.1620213952.1119884.9740416134.3118791.6結(jié)果表明,美羅培南在0.1~40μg/mL之間,濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系,線性方程為Y=0.0881X-0.000381,R2=0.9998,標準曲線上的最低濃度點0.1μg/mL的RSD<15%,具有較高精密度,以標準曲線的最小濃度值0.1μg/mL為定量下限,該方法具有高的靈敏度。2.7回收率試驗取空白血漿,加入一定量的美羅培南標準品溶液,配成濃度分別為30μg/mL(高濃度質(zhì)控樣品),2μg/mL(中濃度質(zhì)控樣品),0.2μg/mL(低濃度質(zhì)控樣品)的樣品各6份,按樣品預(yù)處理方法處理,進樣2μL,得到色譜圖,記錄美羅培南的峰面積為R。另將空白血漿換成等體積的娃哈哈純凈水,與質(zhì)控樣品同樣的方法和步驟處理,加入等量的美羅培南標準品溶液,同法制備相同的高,中,低3個濃度的標準對照樣品,同法測定,得到色譜圖,記錄美羅培南的峰面積為D。將質(zhì)控樣品和標準對照樣品的美羅培南和法羅培南色譜峰面積分別進行比較,計算美羅培南的提取回收率。結(jié)果如表:表2美羅培南和法羅培南提取回收率實驗序號濃度(μg/mL)RDR/D%Average(R/D%)Average(R/D%)10.222153935.8756.2958.7657.072229258.223232859.154218555.515270068.606215654.79722326844461.2152.3356.9582322352.2392536757.05102509856.45112679260.26122818163.381330351312673347.6952.1755.491435413352.591534412751.111639877159.221736911554.821842426563.01結(jié)論:由表可知,美羅培南的低、中、高濃度的回收率分別為58.76%、56.95%、55.49%,總回收率為57.07%。2.8精密度試驗精密吸取空白血漿,分別配制質(zhì)量濃度為40μg/mL(ULOQ質(zhì)控樣品),30μg/mL(高濃度質(zhì)控樣品),2μg/mL(中濃度質(zhì)控樣品),0.2μg/mL(低濃度質(zhì)控樣品),0.1μg/mL(LLOQ質(zhì)控樣品)的樣品各5份,按照樣品預(yù)處理方法處理。每天隨行建立一條標準曲線,并重新配制各濃度質(zhì)控樣品,連續(xù)三天,考察日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果如下:表3日內(nèi)精密度濃度(μg/mL)序號實測值(μg/mL)RSD(%)0.110.091312.2320.11530.11440.092450.09220.210.2046.4620.20630.19140.17850.183211.788.7122.0932.1342.1352.2730129.73.39229.5329.5429.9531.940134.312.34244.5344.9440.6547.9表4日間精密度濃度(μg/mL)序號第一天-實測值(μg/mL)第二天-實測值(μg/mL)第三天-實測值(μg/mL)平均值RSD(%)0.110.09130.1130.1130.117.8420.1150.1050.10530.1140.1120.11240.09240.1010.10150.09220.1070.1070.210.2040.2140.2140.217.5620.2060.2330.23330.1910.1970.19740.1780.2080.20850.1830.2130.213211.781.971.971.9910.9522.091.681.6842.131.831.8352.272.332.3330129.727.827.828.635.61229.525.825.8329.527.827.8429.928.428.4531.929.729.740134.337.337.338.9310.45244.538.638.6344.939.539.5440.63535547.935.535.52.9穩(wěn)定性試驗精密吸取空白血漿,分別配制質(zhì)量濃度為30μg/mL(高濃度質(zhì)控樣品),0.2μg/mL(低濃度質(zhì)控樣品)的樣品各3份,分別考察在室溫條件下放置0,6,12h,24h美羅培南的穩(wěn)定性,并隨行建立一條標準曲線,將美羅培南峰面積和內(nèi)標法羅培南的峰面積比值帶入標準曲線求算美羅培南濃度,分別與0h根據(jù)標準曲線所求算得到的美羅培南濃度進行比較,計算保留比例。表5美羅培南的穩(wěn)定性時間(h)低(μg/mL)中(μg/mL)高(μg/mL)097.33100.1097.50690.26100.03100.2612105.6798.70100.372498.4394.1796.20AVE97.9298.2598.58RSD(%)6.442.852.102.10基質(zhì)效應(yīng)取6種不同空白血漿平分為3組,每份血漿為100μL,加1mL乙腈沉淀蛋白,取上清液200μL留備用。再在上述溶液中加入標準品溶液,分別為以下濃度:低(0.2μg/mL)、中(2μg/mL)、高(30μg/mL)的美羅培南的內(nèi)標法羅培南(200μg/mL),渦旋,離心,取上清,進樣測定峰面積記為T。另取空白試管直接加入相應(yīng)濃度的美羅培南和內(nèi)標法羅培南各10μL,再加入200μL流動相,進樣測定,峰面積記為D。以上同一質(zhì)量濃度、兩種處理方法得到的峰面積比值即為基質(zhì)影響百分比。數(shù)據(jù)如表:表6美羅培南的基質(zhì)效應(yīng)濃度(μg/mL)TDT/D(%)AVE(%)0.242093935.87106.94109.324326109.914343110.354386111.433969100.844583116.4524449344461.21100.07100.2347856107.6347568106.993561080.0945160101.5746681104.9930645256673347.6995.8396.3056497883.91718629106.7262830393.3164272295.45690642102.57內(nèi)標23375.2621856.02106.9599.1821742.4599.4823541.97107.7116730.2976.5521630.6498.9723043.8105.43結(jié)果顯示,低、中、高3個質(zhì)量濃度的美羅培南和內(nèi)標法羅培南的基質(zhì)效應(yīng)影響百分比分別為109.32%,100.23%,96.30%,99.18%,符合方法學(xué)要求,可視為無基質(zhì)效應(yīng)影響。3.討論3.1內(nèi)標化合物的選擇查閱相關(guān)文獻,美羅培南的內(nèi)標化合物有:頭孢他定[4],頭孢曲松,法羅培南等,分別做標準曲線,觀察出峰情況,其中,法羅培南對美羅培南干擾最小,且未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,內(nèi)標法羅培南的響應(yīng)也足夠高,故內(nèi)標化合物選擇法羅培南。3.2蛋白沉淀方法的選擇美羅培南屬于碳青霉烯類抗生素,在血漿中很不穩(wěn)定,在受熱和水解條件下易產(chǎn)生指針型雜質(zhì)[5]。目前實際工作中常用的血漿樣品預(yù)處理方法有:去除蛋白質(zhì)法,液液萃取法(LLE),固相萃取法(SPE)等。其中去除蛋白質(zhì)的方法常用的有:溶劑解法,加入中性鹽,加入強酸,超濾法等。嘗試使用甲醇或乙腈沉淀蛋白,發(fā)現(xiàn)含藥血漿加入甲醇后,形成混懸液,而加入乙腈后,直接出現(xiàn)沉淀物,很明顯,乙腈的沉淀效果更佳,故選用乙腈。含藥血漿加入1mL乙腈,可將90%蛋白質(zhì)沉淀除去。3.3試驗局限性美羅培南在血漿中很不穩(wěn)定,在室溫下也很不穩(wěn)定。通常,采集來的血液樣本,經(jīng)離心后,需要加入穩(wěn)定劑,常用的穩(wěn)定劑,如MES(馬林乙磺酸)等。然而,本實驗樣本不能加入穩(wěn)定劑溶液,因其含有金屬離子,而質(zhì)譜檢測器不能進金屬離子,所以,采集來的樣本,經(jīng)離心提取血漿后,應(yīng)放入冰箱,并盡快測其濃度。4.臨床應(yīng)用美羅培南適用于嚴重感染一種或多種美羅培南敏感的細菌的成人和兒童[6]。包括肺炎、腦膜炎、尿路感染、皮膚軟組織感染、敗血癥。經(jīng)驗性治療,對成人粒細胞減少癥伴發(fā)熱患者,可單獨應(yīng)用本品或聯(lián)合抗病毒藥或抗真菌藥使用。美羅培南單用或與其它抗微生物制劑聯(lián)合使用可用于治療多重感染。目前對于中性粒細胞減少或原發(fā)性、繼發(fā)性免疫缺陷的嬰兒患者,尚無本品的使用經(jīng)驗。藥代動力學(xué)(PK)/藥效學(xué)(PD):美羅培南為時間依賴型抗生素,其抗菌效能取決于給藥間隔內(nèi)藥物濃度超過病原菌最低抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)的時間(t>MIC)。文獻表明[7-9],由于年齡、體重、腎功能、疾病狀態(tài)的不同,患者的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)有較大差異。當(dāng)(t>MIC)接近20%時,可抑制細菌生長,達到40%時具有最大殺菌效應(yīng)[10]。近期研究表明,當(dāng)(t>MIC)>76%時,對下呼吸道感染具有較好的療效。而對于血液感染,(t>MIC)應(yīng)>75%[11]。由于美羅培南在常規(guī)劑量下的毒性反應(yīng)較低,建議對于嚴重感染,盡可能按敏感性折點對MIC進行取值。因此,通過血藥濃度監(jiān)測,結(jié)合微生物培養(yǎng)結(jié)果,能及時調(diào)整給藥方案,對抗菌藥物的合理應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。5.結(jié)論本實驗采用法羅培南作為內(nèi)標物,建立了測定人血漿中美羅培南的血藥濃度的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,線性方程為Y=0.0881X-0.000381,R2=0.9998,定量下限為0.1μg/mL;高,中,低,LLOQ濃度點的美羅培南提取回收率相一致,均在15%左右,并且高,中,低,LLOQ4個濃度點的美羅培南提取回收率的RSD均小于15%,具有良好的精密度和重現(xiàn)性;日內(nèi)、日間RSD均小于15%。且血漿樣品預(yù)處理步驟簡單,可用于快速測定人血漿中美羅培南的濃度。目前該方法已經(jīng)應(yīng)用于臨床上重癥感染患者美羅培南治療藥物濃度監(jiān)測,結(jié)果表明,該方法能夠滿足臨床美羅培南血藥濃度的快速監(jiān)測,為個體化給藥方案的制定提供技術(shù)檢測依據(jù),指導(dǎo)臨床合理用藥,同時也為進行美羅培南重癥感染患者的藥代動力學(xué)研究提供了實驗室依據(jù)。致謝(謝辭)參考文獻[1]殷果,李玉蘭,鄧穎,等.旋光法測定注射用美羅培南的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2004,23(11):865-866.[2]趙國芬,尹翠英.氣相色譜法測定美羅培南中殘留溶劑含量[J].河北化工,2009,32(8):69-70.[3]劉秋連,李松青.熒光共振能量轉(zhuǎn)移光譜法測定尿液中美羅培南的含量[J].中國藥師,2014,12:2016-2018.[4]徐明,王強,史中華,楊莉,韓榮,陳光強,周建新.美羅培南靜脈持續(xù)泵入時血液和腦脊液藥物濃度的測定[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,05:584-586.[5]王楠,胡昌勤,劉茜.表征碳青霉烯類藥物穩(wěn)定性的指針性雜質(zhì)的確定及其應(yīng)用[J].藥物分析雜志,2011,01:90-94.[6]梅丹.新的碳青酶烯類抗生素———美羅培南.中

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