激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)9

激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)LaserScanningConfocalMicroscopyFruitFlyEmbryoNervousSystem目前一頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)LaserScanningConfocalMicroscope目前二頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)使用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，不僅圖像與對(duì)比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長(zhǎng)的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。1、普通熒光顯微鏡的不足目前三頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)1水銀弧光燈2中密度濾片3光鑭4場(chǎng)鑭5激發(fā)濾片6分光鏡（BSP)7物鏡8樣品9,10發(fā)射濾片11目鏡Basicsofconventionalfluorescencemicroscope目前四頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragm-光圈Ocular-目鏡ExcitationFilter目前五頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)ConfocalPrincipleObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilter目前六頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)Differencesbetweenconventionalandconfocalmicroscope1122觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。目前七頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)共聚焦顯微鏡一次只有樣品的小部分區(qū)域被照明，而普通熒光顯微鏡則有更寬的區(qū)域被照明。目前八頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前九頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前十頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)2、共焦顯微鏡發(fā)展歷史

1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，獲得了美國(guó)的專利1967年，Egger和Petran成功地應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫斷面1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關(guān)系和激光掃描器的拉曼光譜學(xué)目前十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)1984年，Biorad為公司推出了世界第一臺(tái)商品化的共聚焦顯微鏡，型號(hào)為SOM-100，掃描方式為臺(tái)階式掃描1986年MRC-500型改進(jìn)為光束掃描，用作生物熒光顯微鏡的共聚焦系統(tǒng)1987年White和Amos在英國(guó)《自然》雜志發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時(shí)代的到來”一文，標(biāo)志著LSCM已成為進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具目前十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)3、顯微鏡成像清晰度的決定因素:

1）.分辨率

2）.球差

3）.色差目前十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)1）、分辨率：

指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點(diǎn)間的距離來表示。目前十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)人眼及各類顯微鏡的分辨率人眼分辨率：0.20mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm電子顯微鏡分辨率：0.20nm目前十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)2）、球差：

是由于透鏡不能把近軸光線和遠(yuǎn)軸光線在光軸上共聚焦，以至透過標(biāo)本一點(diǎn)的光線，在通過透鏡時(shí)不能聚焦成一點(diǎn),而是形成一個(gè)光斑,從而使成像模糊不清。目前十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)3）、色差：

是由于顯微鏡透鏡類似于三棱鏡,對(duì)不同顏色的光線具有不同的折射率。所以光線透過透鏡后,不同色的光聚焦在不同點(diǎn)上,從而使成像模糊,而且像的邊緣尚帶有色暈。目前十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)4、激光掃描共聚焦顯微鏡基本結(jié)構(gòu)

激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)以及圖像輸出設(shè)備等目前二十頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡構(gòu)成激光器光電倍增管檢測(cè)器顯微鏡步進(jìn)器計(jì)算機(jī)電子圖像軟件目前二十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前二十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前二十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)（1）掃描模塊

掃描模塊主要由針孔光欄（控制光學(xué)切片的厚度）、分光鏡（按波長(zhǎng)改變光線傳播方向）、發(fā)射熒光分色器（選擇一定波長(zhǎng)范圍的光進(jìn)行檢測(cè)）、檢測(cè)器（光電倍增管）組成。熒光樣品中的混合熒光進(jìn)入掃描器，經(jīng)過檢測(cè)針孔光欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進(jìn)行檢測(cè)并形成相應(yīng)的共焦圖象，同時(shí)在計(jì)算機(jī)屏幕上可以顯示幾個(gè)并列的單色熒光圖象及其合成圖象目前二十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)（2）熒光顯微鏡系統(tǒng)

顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可方便地在其中插人光學(xué)選件而不影響成像質(zhì)量和測(cè)量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，有利于熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺(tái)的移動(dòng)調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制

目前二十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點(diǎn)：需與掃描器連接，使激光能進(jìn)入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達(dá)檢測(cè)器；需有光路轉(zhuǎn)換裝置，即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時(shí)汞燈光線強(qiáng)度可調(diào)目前二十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)（3）常用激光器

激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)，常用的激光器包括以下三種類型:半導(dǎo)體激光器：405nm（近紫外譜線氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（藍(lán)綠光)氦氖激光器：543nm（綠光-氦氖綠激光器）633nm（紅光—氦氖紅激光器)目前二十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)UV激光器（紫外激光器）：351nm、364nm（紫外光)風(fēng)冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源4）輔助設(shè)備

目前二十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發(fā)射的一定波長(zhǎng)的激發(fā)光，光線經(jīng)放大后通過掃描器內(nèi)的照明針孔光欄形成點(diǎn)光源，由物鏡聚焦于樣品的焦平面上，樣品上相應(yīng)的被照射點(diǎn)受激發(fā)而發(fā)射出的熒光，通過檢測(cè)孔光欄后，到達(dá)檢測(cè)器，并成像于計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點(diǎn)的熒光圖像組成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片基本工作原理目前二十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)

從某種意義上講，共聚焦顯微鏡是一種現(xiàn)代化的光學(xué)顯微鏡，它對(duì)傳統(tǒng)的光鏡從以下幾方面作了改進(jìn)

目前三十頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)

1）、光源

用激光做光源，從理論上消除了色差。因?yàn)榧す獾膯紊詮?qiáng)、光源波束集中、波長(zhǎng)相同。

2）、采用了共扼聚焦技術(shù)

在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)小孔，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差。

目前三十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)共扼聚焦原理圖目前三十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片目前三十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器目前三十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器目前三十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)

普通光學(xué)顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別目前三十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)3）、點(diǎn)與面掃描技術(shù)

共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點(diǎn)，用十分細(xì)小的激光束（點(diǎn)光源）逐點(diǎn)逐行掃瞄、成像，通過計(jì)算機(jī)軟件組合，最后得到一個(gè)整體平面的或立體的像。

普通光鏡：是在可見光源下一次性成像。目前三十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前三十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)Z

通過精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平面的精細(xì)圖象，將一個(gè)連續(xù)的光切圖象Z軸重疊就可形成一個(gè)完整的三維圖象目前三十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前四十頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前四十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前四十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前四十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)4）、圖像信號(hào)及處理：

光電倍增管放大信號(hào)，計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào)。

計(jì)算機(jī)代替了人眼或照相機(jī)進(jìn)行觀察、攝像，得到的圖象是數(shù)字化的，可以在電腦中進(jìn)行處理，再一次提高圖象的清晰度。目前四十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)5、共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1）.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像目前四十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)2）.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片conventionalconfocal目前四十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)3）.增加側(cè)向分辨率

目前四十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)4）.由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響

目前四十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)1）.點(diǎn)照明2）.具有照明pinhole和探測(cè)pinhole3）.照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦),共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面4）.具有掃描系統(tǒng)——逐點(diǎn)掃描成像5）.具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物6、激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)目前四十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)1）.xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x

傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2）.樣品的最大厚度:

取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度

Z軸的最大移動(dòng)范圍(166m、Z-wide)3）.樣品的最小光切厚度:(載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為40nm）取決于:物鏡的NA、針孔大小

Z軸的最小移動(dòng)步距:40nm Z軸的分辨率:0.35m

7、技術(shù)指標(biāo)（LeicaTCSSP2):

目前五十頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)4）.激光器

Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm

激光器的特點(diǎn):1)方向性好:激光基本延直線傳播

2)單色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度 集中的。

4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合目前五十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)5）.四個(gè)熒光通道,一個(gè)透射光通道

即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外 還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光 圖像為非共焦圖像。目前五十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)6）.掃描速度:slow220lines/s5125122-3秒

slow2440lines/s（2：雙向掃描）

medium450lines/s5125121.7秒

medium2900lines/sfast1000lines/s

5125120.7秒

1281280.2秒

fast22000lines/s7）.掃描密度:

646412812851251210241024

20482048目前五十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)8.共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測(cè)針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，最終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。目前五十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)ConfocalPrinciple小孔光圈目前五十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)共聚焦掃描顯微鏡的成像原理激光作為光源采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。掃描方式成像激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。光點(diǎn)共聚焦

光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔（照明針孔和探測(cè)針孔）。直徑約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，最終同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。目前五十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)ConfocalPrinciple照明針孔探測(cè)針孔二色鏡或分光鏡激光光源目前五十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前五十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)目前五十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個(gè)光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。目前六十頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光、近紅外）照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè),數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察LSCM的基本特點(diǎn)目前六十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)

共聚焦顯微鏡真正的威力是依賴于其強(qiáng)烈抑制焦平面外熒光信號(hào)的能力，有很好的深度分辨能力或光學(xué)切片功能?；谠撔再|(zhì)的應(yīng)用包括:樣品的顯微斷層掃描(microscopicCT)Z掃描切片的3-D重建厚樣品的分辨率目前六十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)

多通道同時(shí)檢測(cè)，可實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的生理活動(dòng)和形態(tài)變化:生理學(xué)研究：如細(xì)胞內(nèi)各種離子濃度隨時(shí)間的變化情況.活細(xì)胞多種標(biāo)記物同時(shí)進(jìn)行成像，動(dòng)態(tài)觀察不同形態(tài)學(xué)事件的發(fā)生。如分泌顆粒的分泌過程。目前六十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十五點(diǎn)實(shí)驗(yàn)青蛙冷丙酮、DAPI、甘油/PBS封片劑、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片激光掃描共聚焦顯微鏡目前六十四頁\總數(shù)七十二頁