南農(nóng)-生物分離工程-生物分離1-細(xì)胞破碎(完整)

南農(nóng)--生物分離工程--生物分離1--細(xì)胞破碎(完整)第一頁，共43頁。概述

有些目標(biāo)產(chǎn)物不在發(fā)酵液中，而是存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)不會(huì)被分泌到發(fā)酵液中，而是在細(xì)胞內(nèi)沉積，使胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來一般需要破碎細(xì)胞壁。第二頁，共43頁。 分類

機(jī)械法非機(jī)械法固體剪切法(珠磨法)酶溶法液體剪切法化學(xué)降解法（酸堿法）撞擊法表面活性劑法超聲法干燥法滲透法凍融法第三頁，共43頁。本節(jié)主要研究的是革蘭氏陰性原核生物。其細(xì)胞結(jié)構(gòu)中沒有細(xì)胞核：基因物質(zhì)位于單鏈DNA上。典型的生物是大腸桿菌，是生物技術(shù)研究的主體。通過這種細(xì)胞生產(chǎn)了很多細(xì)胞重組的產(chǎn)物。細(xì)胞膜第四頁，共43頁。Gram-negativeprocaryotes革蘭氏陰性原核生物（E.coli）第五頁，共43頁。革蘭氏陰性細(xì)胞結(jié)構(gòu)有三層：最外層約8mm厚，酶大多數(shù)鑲嵌在這層膜上。革蘭氏陽性原核生物缺少最外層結(jié)構(gòu)，但有第二層肽聚糖層和胞漿空間。第三層為漿膜層或內(nèi)膜層，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性都有這一結(jié)構(gòu)，該層主要由磷脂組成，還有分散的蛋白質(zhì)分子和金屬離子。

第六頁，共43頁。這三層有不同功能。外層及肽聚糖層使細(xì)胞有一定的機(jī)械強(qiáng)度；破壞該層是本章討論的重點(diǎn)。漿膜層和細(xì)胞內(nèi)膜控制細(xì)胞的滲透壓，即將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，將代謝物排出胞外。第七頁，共43頁。真核細(xì)胞，具有真正的細(xì)胞核，其結(jié)構(gòu)要比原核生物復(fù)雜的多，以圖所示的酵母菌為例，和原核細(xì)胞一樣，真核細(xì)胞也具有一層細(xì)胞膜。第八頁，共43頁。動(dòng)物細(xì)胞第九頁，共43頁。植物細(xì)胞模式圖第十頁，共43頁。

破壁難易程度與壁強(qiáng)度、壁厚度、聚合物的種類、細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)細(xì)菌比真菌易破碎G+用溶菌酶G-添加EDTA，除去Ca2+第十一頁，共43頁。

細(xì)胞破碎理論

1)、細(xì)胞破碎A壓撞B剪切C滲透凍脹D破壁破膜2)、產(chǎn)物釋放第十二頁，共43頁。方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法勻漿法（片型）細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中動(dòng)物組織及動(dòng)物細(xì)胞研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理一、機(jī)械法第十三頁，共43頁。

高速珠磨機(jī)珠直徑、數(shù)量、懸浮液濃度、攪拌速度珠磨法第十四頁，共43頁。WSK臥式高效全能珠磨機(jī)Crushinginballmill珠磨法

第十五頁，共43頁。ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī)第十六頁，共43頁。高壓勻漿器第十七頁，共43頁。影響因素操作壓力p：p,R。溫度2C/10MPa。破碎次數(shù)N：N，R。溫度：比速度k與溫度有關(guān)，溫度25C，k1.5倍。細(xì)胞種類：如大腸桿菌比酵母易破碎第十八頁，共43頁。超聲波破碎(15—25kHz)機(jī)理 在超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。發(fā)聲器和換能器

高頻電流→機(jī)械振動(dòng)功率、工作時(shí)間（9S）、間歇時(shí)間、工作次數(shù)、產(chǎn)熱大、實(shí)驗(yàn)室第十九頁，共43頁。

Ultrasonication超聲波超聲波破碎儀

第二十頁，共43頁。超聲破碎法第二十一頁，共43頁。超聲破碎法優(yōu)點(diǎn)：適合于多種細(xì)胞的破碎缺點(diǎn)：A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。第二十二頁，共43頁。JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)第二十三頁，共43頁。研缽第二十四頁，共43頁。

機(jī)械法優(yōu)點(diǎn)A、在大規(guī)模cell破碎中，高壓勻漿機(jī)和珠磨機(jī)用得最多;B、高壓勻漿機(jī)最適合于酵母和細(xì)菌;C、珠磨機(jī)可用于酵母和細(xì)菌，但對(duì)真菌菌絲和藻類更合適.第二十五頁，共43頁。二、非機(jī)械法

第二十六頁，共43頁。方法技術(shù)原理效果成本舉例化學(xué)法滲透沖擊滲透壓破壞細(xì)胞溫和便宜血紅細(xì)胞的破壞酶消化法細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎溫和昂貴增溶法表面活性劑溶解細(xì)胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜甲苯破碎酵母細(xì)胞堿處理法堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解劇烈便宜化學(xué)法第二十七頁，共43頁。OsmoticShock(滲透沖擊法)

最簡(jiǎn)單的是滲透沖擊法。此法將一定體積的細(xì)胞液加到2倍體積的水中，細(xì)胞中溶質(zhì)濃度高，水不斷進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹，最后導(dǎo)致破裂，釋放胞內(nèi)物。第二十八頁，共43頁。細(xì)胞破碎的難易決定于其類型，紅血球細(xì)胞容易溶破，動(dòng)物細(xì)胞只有當(dāng)其組織被機(jī)械切碎或勻漿后才易溶破。植物細(xì)胞很難溶破，因?yàn)橹参锛?xì)胞中含有大量的木質(zhì)成分，通過滲透流很難滲透。第二十九頁，共43頁。滲透流的動(dòng)力來自滲透壓，滲透壓可以通過化學(xué)平衡來估算：

P=RTC

該式稱為范特苛夫定律。許多細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度大約為0.1MNaCl或0.2M溶質(zhì)。第三十頁，共43頁。例：一種耐鹽細(xì)胞其能積累細(xì)胞內(nèi)低分子量鹵化物，適應(yīng)高滲透壓，能在含有0.32mol/LNaCl,0.02mol/LMgCl2,0.015mol/LCaCl2,0.01mol/LFeCl3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)其從含鹽量高的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移至清水中，在數(shù)分鐘內(nèi)能將胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來，試估計(jì)細(xì)胞膜所受滲透壓的大小。（設(shè)操作溫度為25℃）第三十一頁，共43頁。解：細(xì)胞所受滲透壓按照下式計(jì)算：P＝RTC＝

8.314×298×(0.32×2＋0.02×3＋0.015×3＋0.01×4)×103＝1.94×106Pa第三十二頁，共43頁。酶解法陽性菌：溶菌酶，分解糖苷鍵，低滲溶液破裂陰性菌：EDTA-溶菌酶、甘氨酸-溶菌酶、青霉素法（抑制細(xì)胞壁合成）酵母菌：蝸牛酶、纖維素酶霉菌：幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶自溶作用：加熱、干燥誘發(fā)第三十三頁，共43頁。第三十四頁，共43頁。凍-融法細(xì)胞-15℃冷凍、室溫融化細(xì)胞膜疏水鍵破裂，胞內(nèi)水結(jié)晶膨脹破裂溫和、破碎率低第三十五頁，共43頁。干燥法細(xì)胞膜滲透性改變，易抽提（丙酮、丁醇）空氣干燥（酵母）25-30℃熱空氣真空干燥（細(xì)菌）噴霧、冷凍干燥（不穩(wěn)定生化物質(zhì)）第三十六頁，共43頁。非機(jī)械法優(yōu)點(diǎn)：A、產(chǎn)品釋放的選擇性；B、提取速度和收效高；C、產(chǎn)品的破壞??；D、對(duì)外界環(huán)境，如pH和溫度等要求低。第三十七頁，共43頁。機(jī)械法和非機(jī)械法的比較

機(jī)械破碎法缺點(diǎn)：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離。

非機(jī)械破碎法缺點(diǎn)：A、引起新的污染，尤其是其他化學(xué)方法；B、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。第三十八頁，共43頁。 細(xì)胞破碎的評(píng)價(jià)

破碎率定義 N0：原細(xì)胞數(shù)，N：破碎后殘存的正常細(xì)胞。N0和N的可通過直接計(jì)數(shù)和間接計(jì)數(shù)法得到。直接計(jì)數(shù)法方法：樣本稀釋---染色---上樣計(jì)數(shù)。計(jì)算：同上。優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：A、計(jì)數(shù)時(shí)間長(zhǎng)B、細(xì)胞聚集時(shí)，不利計(jì)數(shù)C、染色誤差。第三十九頁，共43頁。細(xì)胞破碎的評(píng)價(jià)間接計(jì)數(shù)法方法：樣本離心---取上清液---測(cè)特定蛋白質(zhì)或酶---與理論的最大值比較。(紫球藻細(xì)胞藻紅蛋白)計(jì)算：Y(%)=100×(R/Rm) Rm：理論最大值，R：實(shí)驗(yàn)測(cè)得值。優(yōu)點(diǎn)：A、方法客觀可靠，尤其對(duì)蛋白質(zhì)和酶，B、有多種選擇的指標(biāo)，胞內(nèi)位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，靈活性大。缺點(diǎn)：影響因素多，如溫度、pH值、剪切力、溶液的稀釋等。解決辦法：篩選相對(duì)穩(wěn)定和恒定的指標(biāo)。第四十頁，共43頁。基因工程表達(dá)產(chǎn)物存在的問題A、包含體B、N-端多一個(gè)蛋氨酸殘基、表達(dá)產(chǎn)物未糖基化（大腸桿菌）C、表達(dá)產(chǎn)物過度糖基化，目標(biāo)產(chǎn)物變成抗原（酵母）D、大腸桿菌的內(nèi)毒素包含體（一般步驟）A、包含體的分離B、包含體溶解、變性、還原，一般用尿素、鹽酸胍、SDSC、變形蛋白質(zhì)的復(fù)性D、一般的分離純化第四十一頁，共43頁。

基因工程表達(dá)產(chǎn)物例：人-干擾素的后處理工藝發(fā)酵液離心(發(fā)酵液冷卻至10C以下，4000r/min離心10min)菌體細(xì)胞破碎(1倍體積細(xì)胞+10倍體積buffer,冰浴超聲破碎5次,30s/次,4000r/min離心30min)，洗滌(