血紅蛋白提取

血紅蛋白提取第1頁/共50頁思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。第2頁/共50頁第3頁/共50頁思考3高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思考4人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人(豬、牛、羊）的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。第4頁/共50頁一、基礎(chǔ)知識(shí)：㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離。第5頁/共50頁3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，（）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動(dòng)速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動(dòng)，路程（），移動(dòng)速度（），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。4、具體過程相對(duì)分子質(zhì)量較小較長(zhǎng)較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快第6頁/共50頁第7頁/共50頁第8頁/共50頁1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制（）對(duì)溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值第9頁/共50頁3、緩沖溶液的配制

通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內(nèi)

思考：說出人體血液中緩沖對(duì)。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3第10頁/共50頁㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。思考：在血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）第11頁/共50頁2、原理：許多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，這些基團(tuán)會(huì)帶上（）。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其（）移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子（）以及分子本身（）、（）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。多肽、核酸可解離的基團(tuán)正電或負(fù)電所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度一定的PH第12頁/共50頁第13頁/共50頁聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑(過硫酸銨和催化劑（四甲基已二胺）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。測(cè)定（）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量第14頁/共50頁二實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：1.樣品處理血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（）兩個(gè)a－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定共四條肽鏈90％第15頁/共50頁第16頁/共50頁①目的：去除（）②方法：（）離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的（），將下層（）的紅細(xì)胞液體倒入（）每個(gè)肽鏈環(huán)繞（），此基團(tuán)可攜帶（）。血紅蛋白因含有（）而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白。一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)一分子氧或一分子二氧化碳血紅素(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時(shí)間黃色血漿暗紅色燒杯第17頁/共50頁再加入用（）的（）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌⑤低速離心（低速短時(shí)間）⑥重復(fù)4、5步驟（）次，直至上清液中已沒有（），表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。五倍體積生理鹽水三黃色第18頁/共50頁(2)血紅蛋白的釋放

加（）到（）體積，再加40％體積的（）（溶解細(xì)胞膜），置于（）上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白.(3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水第19頁/共50頁第1層（最上層）：（）甲苯層第2層（中上層）：（）的沉淀層，（）色薄層固體第3層（中下層）：

（）的水溶液層（）的液體

第4層（最下層）：其它雜質(zhì)（）的沉淀層無色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色第20頁/共50頁用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第21頁/共50頁取()ml的血紅蛋白溶液裝入（）中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的（）中，pH為（），透析12小時(shí)，目的是（）或用于更換樣品中的（）。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)透析袋磷酸緩沖液7.0緩沖液(4)透析1第22頁/共50頁第23頁/共50頁2.凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的（），在0.5ml的（）頭部切下（）長(zhǎng)的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm第24頁/共50頁底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。注意c.剪尼龍網(wǎng)小圓片覆蓋在（）上，用（）的尼龍紗將橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。d、色譜柱下端用移液頭部做（），連接一細(xì)的（），并用螺旋夾控制尼龍管的（），另一端放入收集（）的收集器內(nèi)橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龍管打開與關(guān)閉色譜流出液第25頁/共50頁⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。③頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。第26頁/共50頁2）凝膠色譜柱填料的處理（1）凝膠的選擇：（）（G-75）

“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。

75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。（2）方法：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于（）中充分溶脹后，配成（）。蒸餾水凝膠懸浮液交聯(lián)葡聚糖凝膠第27頁/共50頁①固定：將色譜柱處置固定在支架上②裝填：將（）一次性的緩慢倒入（）內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。（3）凝膠色譜柱的裝填方法凝膠懸浮液色譜柱注意：凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時(shí)不能有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第28頁/共50頁③洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在()高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分（）12小時(shí)。

洗滌平衡注意液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則重新填裝。50cm第29頁/共50頁3）樣品加入與洗脫①加樣前

打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面第30頁/共50頁②加透析樣品第31頁/共50頁①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用（）將1ml（）的樣品加到色譜柱的（）③樣品滲入凝膠床：（）④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待（）接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每（）收集一試管連續(xù)收集注意正確的加樣操作：

①不要觸及破壞凝膠面②貼壁加樣

③使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)吸管透析液頂端樣品完全進(jìn)凝膠層5ml紅色的蛋白質(zhì)第32頁/共50頁血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。思考第33頁/共50頁血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（）；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的（）；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行（）。思考樣品的粗分離純化純度鑒定第34頁/共50頁3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷（）的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。純化第35頁/共50頁3.SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度（1）試劑的配制①丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺

用去離子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液②十二烷基硫酸鈉（SDS）

用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。③用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液④TEMED：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。第36頁/共50頁⑤用去離子水配制10%

過硫酸銨：作用提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。⑥Tris—甘氨酸電泳緩沖液

25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦樣品處理液

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油。⑧染色液

0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸⑨脫色液

10%的甲醇和10%的冰醋酸。第37頁/共50頁由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。TEMED和過硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。第38頁/共50頁①SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備1)根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板2）SDS—聚丙烯酰胺凝膠制備用去離子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris緩沖液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的過硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長(zhǎng)再加0.5cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高2—3mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。（2）電泳方法步驟第39頁/共50頁③配制SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris緩沖液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的過硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。②分離膠聚合完全后（約30min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。3）樣品處理第40頁/共50頁5)加樣在電泳樣品中按1∶1體積比加入樣品處理液，在100℃溫度下加熱3min，以使蛋白質(zhì)變性。

按順序加樣，加樣量通常為10—25μL。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前)的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品4）濃縮膠聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。第41頁/共50頁7）剝膠

從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。8）染色

將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1-2h。6)電泳將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后