細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

一、基本目標(biāo)了解細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)知識(shí)和無(wú)菌操作基本標(biāo)準(zhǔn)掌握貼壁細(xì)胞復(fù)蘇方法；掌握鏡下觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)方法了解細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第1頁(yè)二、試驗(yàn)內(nèi)容細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞觀察細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第2頁(yè)三、試驗(yàn)材料及儀器1、材料：人肺癌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640液體培養(yǎng)基,10％胎牛血清,雙抗100單位/ml）PBS

細(xì)胞培養(yǎng)耗材2、儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡生物安全柜液氮罐

離心機(jī)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第3頁(yè)四、細(xì)胞復(fù)蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，快速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)基稀釋至原體積10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)剛復(fù)蘇細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第4頁(yè)基本概念細(xì)胞系（Cellline）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系。細(xì)胞株（Cellstrain）：經(jīng)過選擇法或克隆法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中取得含有特殊性質(zhì)或標(biāo)志培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第5頁(yè)有限細(xì)胞系（finitecellline）：細(xì)胞系形成后僅能維持有限傳代次數(shù)，最終死亡。連續(xù)或無(wú)限細(xì)胞系（continuouscelllineorinfinitecellline）：含有沒有限繁殖能力（取得不死性）和能重復(fù)進(jìn)行傳代細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第6頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)可長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控、檢測(cè)，定量評(píng)定一部分活細(xì)胞情況。研究條件可人為控制。研究樣本能夠到達(dá)比較均一性。研究?jī)?nèi)容便于觀察、檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)。研究范圍比較廣泛。研究費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第7頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)缺點(diǎn)生存在人工培養(yǎng)環(huán)境中，即使模擬體內(nèi)環(huán)境，但仍有很大差異。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第8頁(yè)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面檢測(cè)肉眼觀察培養(yǎng)基顏色改變桃紅色：正常情況橙黃色:細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好淡黃色:培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)不足,死亡細(xì)胞過多紫紅色:細(xì)胞沒有生長(zhǎng)、生長(zhǎng)狀態(tài)不好、或已死亡細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第9頁(yè)相差顯微鏡觀察活細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好：透明度大，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，沒有空泡，胞膜清楚。培養(yǎng)上清清澈透明，看不到懸浮細(xì)胞或碎片。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良：胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和顆粒物質(zhì)，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則，甚至失去原來特點(diǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第10頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）試驗(yàn)前準(zhǔn)備依據(jù)試驗(yàn)要求，將所需物品及試劑滅菌消毒。清點(diǎn)所需用具，一并放入超凈臺(tái)內(nèi)；細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第11頁(yè)（二）無(wú)菌室和操作野消毒

試驗(yàn)前，將試驗(yàn)器材放人超凈臺(tái)內(nèi)，打開超凈臺(tái)紫外線滅菌燈，照射30分鐘，關(guān)閉紫外線燈，同時(shí)起動(dòng)超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第12頁(yè)（三）無(wú)菌操作基本要求洗手、著裝與外科臨床要求相同；手指不能觸及器材使用端；一切操作都要在火焰周圍進(jìn)行，瓶口要順風(fēng)斜放在支架上，試劑使用后馬上封閉瓶口；細(xì)胞培養(yǎng)各用液要專管專用，并要勤換吸管瓶口液滴不能再進(jìn)入瓶?jī)?nèi)；動(dòng)作要準(zhǔn)確靈敏，盡可能防止空氣流動(dòng)；在試驗(yàn)過程中，不要面向操作野講話或咳嗽。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第13頁(yè)（四）試驗(yàn)后要求關(guān)閉超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)和電源；用過玻璃器材投入清水中浸泡，包裝紙疊卷，繩成束分類歸放；最終用酒精紗布或棉球擦拭工作臺(tái)面。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第14頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)基本條件無(wú)菌條件細(xì)胞生長(zhǎng)條件細(xì)胞檢測(cè)條件細(xì)胞保留條件試驗(yàn)室安全細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第15頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌環(huán)境

無(wú)菌室結(jié)構(gòu)：普通由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。（使用前）紫外照射（1小時(shí)）每七天甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和每個(gè)月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次方式進(jìn)行消毒細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第16頁(yè)生物安全柜

使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射30分鐘，預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。使用完成后，要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四面擦拭潔凈。還要定時(shí)用福爾馬林熏蒸。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第17頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第18頁(yè)火焰消毒在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先關(guān)鍵點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。培養(yǎng)瓶滴管、試管、吸管細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第19頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)用具

細(xì)胞培養(yǎng)瓶

25平方厘米，正方斜頸25平方厘米，三角斜頸75平方厘米，正方斜頸75平方厘米，三角斜頸150平方厘米，正方斜頸

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第20頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)板

6孔12孔24孔48孔96孔

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第21頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)皿

35mm

60mm

100mm

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第22頁(yè)凍存管

1.2ml2ml5ml細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第23頁(yè)離心管

15ml

50ml細(xì)胞刮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第24頁(yè)濾器細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第25頁(yè)液氮罐細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第26頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第27頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第28頁(yè)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)碳水化合物、氨基酸和脂類三大類也需要一定量無(wú)機(jī)鹽、維生素和微量元素細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第29頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)液

水平衡鹽溶液pH調(diào)整液消化液抗生素溶液培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第30頁(yè)平衡鹽溶液主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成作用：維持滲透壓、緩沖和調(diào)整酸堿度慣用緩沖液：生理鹽水

PBSHanks液

（D-Hank‘s慣用于配制胰酶溶液）細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第31頁(yè)pH調(diào)整液(1)碳酸氫鈉液(2)Hepes緩沖液是一個(gè)能夠保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定氫離子緩沖劑通常使用濃度為10～15mM細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第32頁(yè)

消化液胰蛋白酶溶液主要作用是使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開來慣用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA溶液作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間連接。對(duì)于一些貼壁尤其牢靠細(xì)胞，可用EDTA和胰酶混合液

EDTA溶液使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶(3)膠原酶溶液膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用對(duì)象是膠原組織，所以不輕易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第33頁(yè)抗生素溶液通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。

培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第34頁(yè)培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：血清血漿組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第35頁(yè)合成培養(yǎng)基

依據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成。包含四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物當(dāng)前慣用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、MEM另有沒有血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第36頁(yè)牛血清胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)胎牛新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)新生牛小牛血清取自出生10－30天小牛使用濃度：普通為5－20％，最慣用是10％

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第37頁(yè)無(wú)機(jī)鹽CaCl2

、KCl、MgSO4、

NaCl、NaHCO3

、NaH2PO4對(duì)調(diào)整細(xì)胞滲透壓、一些酶活性及溶液酸堿度都是必須。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第38頁(yè)氨基酸

纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)必需原料，不能由其它氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成谷氨酰胺含有特殊作用，補(bǔ)加一定量谷氨酰胺。L-谷氨酰胺降解造成氨形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞含有毒性。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第39頁(yè)真核細(xì)胞

培養(yǎng)、凍存、計(jì)數(shù)試驗(yàn)（下）指導(dǎo)老師：鞏麗云

楊一生物化學(xué)和分子生物學(xué)教研室醫(yī)學(xué)院712細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第40頁(yè)傳代將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)細(xì)胞在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，因?yàn)榭臻g不足或細(xì)胞密度過大造成營(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，所以需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。

HepG2細(xì)胞

細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞；

培養(yǎng)天數(shù)：傳代培養(yǎng)2天；

細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：呈多角型、不規(guī)則貼壁生長(zhǎng)，成團(tuán)聚集。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第41頁(yè)傳代注意事項(xiàng)接種數(shù)量為5×104～8×105個(gè)/ml

傳代密度太低，細(xì)胞輕易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在到達(dá)增加前有較長(zhǎng)滯留期。培養(yǎng)液因?yàn)閜H下降而展現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)到達(dá)最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。假如是單層貼壁細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第42頁(yè)體外培養(yǎng)細(xì)胞分型

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第43頁(yè)貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第44頁(yè)1、成纖維細(xì)胞型

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似起源：由中胚層間充質(zhì)組織起源組織如：真正成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等突起，中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離單獨(dú)成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)細(xì)胞突起細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第45頁(yè)成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第46頁(yè)

HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+15％胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭形，扁平形或多角形，貼壁生長(zhǎng)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代；

2.培養(yǎng)天數(shù)：7天；

3.放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；

4.培養(yǎng)基種類：DF12+10％FBS；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：使用percoll密度梯度離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液48h，這是7天后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第47頁(yè)2、上皮型細(xì)胞名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同起源：起源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，極少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第48頁(yè)上皮型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第49頁(yè)SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）

1.細(xì)胞種類：SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）2.培養(yǎng)天數(shù)：傳代后3d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快。

CCL-149

1.細(xì)胞種類：大鼠肺泡上皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)天數(shù)：1d（種在48孔板中）；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭形，透亮貼壁生長(zhǎng)，3－4天傳代一次，Giemsa染色。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第50頁(yè)3、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，普通不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其它細(xì)胞相區(qū)分。

CNE1

1.細(xì)胞種類：高分化鼻咽癌細(xì)胞系；

2.培養(yǎng)天數(shù)：3d；

3.放大倍速：相差100；

4.培養(yǎng)基種類：PMI1640+10%CS；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，梭型成團(tuán)生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第51頁(yè)4、多型細(xì)胞型有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定形態(tài)，可統(tǒng)歸于這類。

SD大鼠神經(jīng)元原代

1.細(xì)胞種類：腦皮質(zhì)細(xì)胞；

2.培養(yǎng)天數(shù)：4-5天；

3.放大倍速：電鏡0；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清+10%馬血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，有多量軸突和樹突。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第52頁(yè)懸浮型概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)起源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，

易于收獲，可取得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第53頁(yè)HL-60分化細(xì)胞Giemsa染色1.細(xì)胞種類：HL-60；

2.培養(yǎng)天數(shù)：ATRA1微摩爾作用5天；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：1640+8％胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：懸浮細(xì)胞，分化細(xì)胞核漿百分比減小，核仁降低或消失，胞核呈桿狀或分葉狀。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第54頁(yè)

KU812

1.細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；

2.培養(yǎng)天數(shù)：5d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第55頁(yè)

HeLa細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)；

2.培養(yǎng)天數(shù)：7d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X200；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈多角形，貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第56頁(yè)

K562細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：K562（人慢性紅白血病細(xì)胞株）；

2.培養(yǎng)天數(shù)：傳代后2天；

3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，4mMGlutamine；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征介紹：懸浮生長(zhǎng)，少數(shù)貼壁，喜愛成團(tuán)懸浮。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第57頁(yè)

每代貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久停頓期（平臺(tái)期）細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第58頁(yè)游離期

懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。吸附期

貼附底物，普通24小時(shí)內(nèi)貼壁。潛伏期

此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。細(xì)胞株潛伏期普通為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久

細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間改變成倍增加，活力最正確，最適合進(jìn)行試驗(yàn)研究。停頓期（平臺(tái)期）

細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第59頁(yè)細(xì)胞培養(yǎng)污染和檢測(cè)細(xì)胞污染種類細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源無(wú)菌操作技術(shù)不妥操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第60頁(yè)

細(xì)菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第61頁(yè)白色念珠菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第62頁(yè)真菌感染

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第63頁(yè)支原體污染電鏡照片,煎蛋狀和其它形狀細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第64頁(yè)熒光染色法(33258)顯示染色體，細(xì)胞周圍亮點(diǎn)為支原體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第65頁(yè)Giemsa染色法，附于胞質(zhì)上黑點(diǎn)為支原體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第66頁(yè)掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多圓形顆粒為支原體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)第67頁(yè)依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)恃點(diǎn)，傳代方法有3種：1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。2．半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）