血紅蛋白的提取和分離自制

(一）蛋白質(zhì)占細胞干重50％以上，細胞中含量最多有機物2、組成元素C、H、O、N一、基礎(chǔ)知識1、含量3、相對分子質(zhì)量高分子化合物血紅蛋白的提取和分離自制第1頁4、基本組成單位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸連接方式脫水縮合寫出氨基酸脫水縮合形成二肽示意圖血紅蛋白的提取和分離自制第2頁氨基酸結(jié)合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH血紅蛋白的提取和分離自制第3頁氨基酸結(jié)合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH血紅蛋白的提取和分離自制第4頁氨基酸結(jié)合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽鍵脫水縮合血紅蛋白的提取和分離自制第5頁氨基酸結(jié)合方式:脫水縮合肽鍵CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O血紅蛋白的提取和分離自制第6頁氨基酸結(jié)合方式:脫水縮合CCHR1NH2COCHR2HNO肽鍵二肽CHCOOHR3HNH2O肽鍵三肽以這類推，由多個氨基酸分子縮合而成含有多個肽鍵化合物，叫多肽（鏈狀）。肽鏈盤曲，折疊，形成有一定空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子。H2O血紅蛋白的提取和分離自制第7頁8、分子結(jié)構(gòu)7、肽鍵CONH氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤波折疊（一條或者多條）血紅蛋白的提取和分離自制第8頁10、生理功效細胞和生物體結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新主要原料，含有運輸、調(diào)整、免疫、催化等作用，是一切生命活動主要負擔(dān)者氨基酸種類不一樣；數(shù)目成百上千；排列次序改變多端；多肽鏈空間結(jié)構(gòu)千差萬別9、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)多樣性血紅蛋白的提取和分離自制第9頁①氨基酸間脫水縮合時，原來氨基和羧基就不存在了，形成化合物即多肽一端只有一個氨基，另一端只有一個羧基（不計R基上氨基和羧基）。所以對于一條多肽鏈說，最少應(yīng)有氨基和羧基都是一個②若有個n氨基酸分子縮和成m條肽鏈,則可形成________個肽鍵,脫去______個水分子，至有氨基和羧基各____個11、相關(guān)計算n-mn-mm血紅蛋白的提取和分離自制第10頁③蛋白質(zhì)能夠含有一條或n條肽鏈、肽鏈經(jīng)過化學(xué)鍵（如二硫鍵）相互連接，含有不一樣空間結(jié)構(gòu)血紅蛋白的提取和分離自制第11頁血紅蛋白的提取和分離自制第12頁④關(guān)于蛋白質(zhì)相對分子量計算：n個氨基酸形成m條肽鏈，每個氨基酸平均相對質(zhì)量為a,那么由此形成蛋白質(zhì)相對分子量為______________n·a-(n-m)·18血紅蛋白的提取和分離自制第13頁課題3血紅蛋白提取和分離血紅蛋白的提取和分離自制第14頁思索1分離生物大分子基本思緒是什么？選取一定物理或化學(xué)方法分離含有不一樣物理或化學(xué)性質(zhì)生物大分子。思索2蛋白質(zhì)分離和提取原理是什么？依據(jù)蛋白質(zhì)各種特征差異分子形狀和大小所帶電荷性質(zhì)和多少溶解度分離不一樣蛋白質(zhì)血紅蛋白的提取和分離自制第15頁思索3高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思索4人們用雞紅細胞提取DNA，用人紅細胞提取血紅蛋白原因是什么？雞紅細胞含有細胞核，含有DNA，便于進行DNA提取，人紅細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。血紅蛋白的提取和分離自制第16頁

一、凝膠色譜法原理一些微小多孔球體內(nèi)含許多貫通通道，由多糖類化合物組成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔凝膠就叫分子篩什么是凝膠？血紅蛋白的提取和分離自制第17頁原理：當(dāng)不一樣蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠時相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較大凝膠內(nèi)部通道輕易進入無法進入凝膠內(nèi)部通道只能在凝膠外部移動旅程較長移動速度較慢旅程較短移動速度較快相對分子質(zhì)量不一樣蛋白質(zhì)所以得以分離。血紅蛋白的提取和分離自制第18頁血紅蛋白的提取和分離自制第19頁血紅蛋白的提取和分離自制第20頁緩沖溶液配制

調(diào)整緩沖劑（）就能夠制得（）使用緩沖液。1－2使用百分比在不一樣PH范圍內(nèi)

通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。血紅蛋白的提取和分離自制第21頁(1)0.2mol/LNa2HPO4溶液

將71.64gNa2HPO4·12H2O溶解在1000mL蒸餾水中

(2)0.2mol/LNaH2PO4溶液將31.21gNaH2PO4·2H2O溶解在1000mL蒸餾水中血紅蛋白的提取和分離自制第22頁pHpH5.8

6.0

6.2

6.4

6.6

6.88.0

12.3

18.5

26.5

37.5

49.092.0

87.7

81.5

73.5

62.5

51.07.0

7.2

7.4

7.6

7.8

8.061.0

72.0

81.0

87.0

91.5

94.739.0

28.0

19.0

13.0

8.5

5.30.2mol/LNaH2PO4/mL0.2mol/LNa2HPO4/mL0.2mol/L0.2mol/LNaH2PO4/mLNa2HPO4/mL血紅蛋白的提取和分離自制第23頁思索：在血紅蛋白整個試驗室中用緩沖液是什么？它目標(biāo)是什么？使用是磷酸緩沖液，目標(biāo)是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)PH環(huán)境，確保血紅蛋白正常結(jié)構(gòu)和功效，便于觀察（紅色）和材料科學(xué)研究（活性）血紅蛋白的提取和分離自制第24頁二、電泳原理概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移過程。血紅蛋白的提取和分離自制第25頁待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)差異大小、形狀不一樣帶電分子產(chǎn)生不一樣遷移速度血紅蛋白的提取和分離自制第26頁血紅蛋白的提取和分離自制第27頁1、蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率取決于

等原因。分子大小它所帶靜電荷多少以及分子大小2、SDS：十二烷基硫酸鈉為了消除靜電荷對遷移率影響SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負電荷量大大超出了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不一樣種蛋白質(zhì)間電荷差異，使電泳遷移率完全取決于()。血紅蛋白的提取和分離自制第28頁電泳檢測PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳血紅蛋白的提取和分離自制第29頁課堂小結(jié)：血紅蛋白的提取和分離自制第30頁1、凝膠色譜法原理：當(dāng)不一樣蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠時相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較大凝膠內(nèi)部通道輕易進入無法進入凝膠內(nèi)部通道只能在凝膠外部移動旅程較長移動速度較慢旅程較短移動速度較快相對分子質(zhì)量不一樣蛋白質(zhì)所以得以分離。血紅蛋白的提取和分離自制第31頁待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)差異大小、形狀不一樣帶電分子產(chǎn)生不一樣遷移速度2、凝膠電泳原理血紅蛋白的提取和分離自制第32頁二試驗操作蛋白質(zhì)提取和分離普通分為四步：1.樣品處理和粗分離血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（）兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈樣品處理和粗分離——純化——純度判定共四條肽鏈90％血紅蛋白的提取和分離自制第33頁亞鐵血紅素集團血紅蛋白的提取和分離自制第34頁血紅蛋白的提取和分離自制第35頁紅細胞洗滌血紅蛋白的提取和分離自制第36頁樣品處理和粗分離1、紅細胞洗滌：目標(biāo)是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉預(yù)防血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放血紅蛋白的提取和分離自制第37頁磁力攪拌器血紅蛋白的提取和分離自制第38頁攪拌器轉(zhuǎn)子血紅蛋白的提取和分離自制第39頁攪拌器正在工作血紅蛋白的提取和分離自制第40頁3、分離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。血紅蛋白的提取和分離自制第41頁第1層（最上層）：（）甲苯層第2層（中上層）：（）沉淀層，（）色薄層固體第3層（中下層）：

（）水溶液層（）液體

第4層（最下層）：其它雜質(zhì)（）沉淀層無色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色血紅蛋白的提取和分離自制第42頁用濾紙過濾，除去紅細胞破碎物沉淀，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層紅色透明液體。血紅蛋白的提取和分離自制第43頁4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。血紅蛋白的提取和分離自制第44頁血紅蛋白的提取和分離自制第45頁利用透析袋透析血紅蛋白的提取和分離自制第46頁血紅蛋白的提取和分離自制第47頁二、凝膠色譜純化血紅蛋白的提取和分離自制第48頁2.凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱制作①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。血紅蛋白的提取和分離自制第49頁血紅蛋白的提取和分離自制第50頁2）凝膠色譜柱填料處理（1）凝膠選擇：（）（G-75）

“G”表示凝膠交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。

75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。（2）方法：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量凝膠浸泡于（）中充分溶脹后，配成（）。蒸餾水凝膠懸浮液交聯(lián)葡聚糖凝膠血紅蛋白的提取和分離自制第51頁①固定：將色譜柱處置固定在支架上②裝填：將（）一次性遲緩倒入（）內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。（3）凝膠色譜柱裝填方法凝膠懸浮液色譜柱血紅蛋白的提取和分離自制第52頁③洗滌平衡裝填完成后，馬上用緩沖液洗脫瓶，在()高操作壓下，用300ml20mmol/l磷酸緩沖液（pH為7.0）充分（）12小時。

洗滌平衡50cm血紅蛋白的提取和分離自制第53頁血紅蛋白的提取和分離自制第54頁3）樣品加入與洗脫①加樣前

打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上（）遲緩下降到與（）平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面血紅蛋白的提取和分離自制第55頁②加透析樣品注意正確加樣操作：①不要觸及破壞凝膠面②貼壁加樣③使吸管管口沿管壁圍繞移動血紅蛋白的提取和分離自制第56頁①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用（）將1ml（）樣品加到色譜柱（）③樣品滲透凝膠床：（）④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤搜集：待（）靠近色譜柱底端時，用試管搜集流出液，每（）搜集一試管連續(xù)搜集吸管透析液頂端樣品完全進凝膠層5ml紅色蛋白質(zhì)血紅蛋白的提取和分離自制第57頁開始進行層析血紅蛋白的提取和分離自制第58頁搜集得到純化后蛋白血紅蛋白的提取和分離自制第59頁試驗錄像血紅蛋白的提取和分離自制第60頁血紅蛋白是有色蛋白，所以在凝膠色譜分離時能夠經(jīng)過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該搜集洗脫液。這使血紅蛋白分離過程非常直觀，大大簡化了試驗操作。思索血紅蛋白的提取和分離自制第61頁血紅蛋白提取和分離程序可分為四大步，包含：樣品處理、粗分離、純化和純度判定。首先經(jīng)過洗滌紅細胞、血紅蛋白釋放、離心等操作搜集到血紅蛋白溶液，即樣品處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小雜質(zhì)，即（）；然后經(jīng)過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品（）；最終經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行（）。思索樣品粗分離純化純度判定血紅蛋白的提取和分離自制第62頁三、純度判定血紅蛋白的提取和分離自制第63頁血紅蛋白的提取和分離自制第64頁3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷（）蛋白質(zhì)是否到達要求，需要進行蛋白質(zhì)判定。純化血紅蛋白的提取和分離自制第65頁試驗錄像血紅蛋白的提取和分離自制第66頁觀察你處理血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），假如分層不顯著，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白原因。另外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白提取純度。三試驗結(jié)果分析與評價血紅蛋白的提取和分離自制第67頁注意：凝膠裝填時盡可能緊密，以降低凝膠顆粒之間空隙。裝填凝膠柱時不能有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)洗脫次序，降低分離效果。洗滌平衡注意液面不要低于凝膠表面，不然可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)流動與最終生物大分子物質(zhì)分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆?，F(xiàn)象，不然重新填裝。血紅蛋白的提取和分離自制第68頁因為凝膠是一個半透明介質(zhì)，所以能夠在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直日光燈，檢驗?zāi)z是否裝填得均勻。另外，還能夠加入大分子有色物質(zhì)，比如藍色葡聚糖—或紅色葡聚糖，觀察色帶移動情況。假如色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱性能良好。假如色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。血紅蛋白