蛋白質(zhì)肽的教案

蛋白質(zhì)肽的教案第1頁/共70頁第三節(jié)肽(peptides)

一、肽的定義與肽鍵二、肽的書寫三、自然界中存在的小肽四、肽的理化性質(zhì)第2頁/共70頁蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)學(xué)說的證據(jù)：肽鍵是一個(gè)酰胺鍵。（1）蛋白質(zhì)水解前后的結(jié)果分析。（2）人工合成的多肽和天然蛋白質(zhì)，都可被蛋白水解酶水解，人工合成多肽中氨基酸是肽鍵連接的。（3）天然蛋白質(zhì)有雙縮脲反應(yīng)。（4）人工合成的聚合aa的X-光衍射譜和紅外光譜與天然纖維蛋白相似。（5）結(jié)晶牛胰島素的成功，完全證明了蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)學(xué)說的正確性。一、蛋白質(zhì)中氨基酸之間的連接鍵是主要的是肽鍵

第3頁/共70頁NH2COOH1NH2COOH2NH2C

NCOOHOH21兩個(gè)氨基酸分子頭尾連接起來肽鍵的形成脫水CarbodiimideJuangRH(2004)BCbasics第4頁/共70頁肽的結(jié)構(gòu)與肽鍵第5頁/共70頁氨基酸借肽鍵連接的分子叫肽，肽是一大類物質(zhì)，即：

1）兩個(gè)氨基酸組成的肽叫二肽；

2）三個(gè)氨基酸組成的肽叫三肽；3）多個(gè)氨基酸組成的肽叫多肽；4）氨基酸借肽鍵連成長鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有自由-NH2和-COOH，自由-NH2端稱為N-末端（氨基末端），自由-COOH端稱為C-末端（羧基末端）；

5）構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基；

6）肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-NH2端開始，由N指向C，即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾。二、肽的定義與結(jié)構(gòu)

第6頁/共70頁單位小分子

N-C-C-N-C-C-N-C-C-碳為中心

N-C-C-N-C-C-N-C-C兩端氨基酸

N-C-C-N-C-C-N-C-C肽鍵的定位

N-C-C-N-C-C-N-C-C肽的結(jié)構(gòu)分析JuangRH(2004)BCbasics第7頁/共70頁肽的書寫寫法：從左右，從N末端C末端。三字母用連線，也有用單字母的。讀法：××酰—××?！痢了帷懛ǎ篠er-Gly-Tyr-Ala-Leu或SGTAL，名稱：絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸第8頁/共70頁p

軌道電子共振使肽鍵具雙鍵特性

HCCNCOJuangRH(2004)BCbasicsδ-δ+第9頁/共70頁NCCHNC●肽鍵

雖是單鍵卻有雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)O●肽鍵

周圍六個(gè)原子在同一平面（酰氨平面）上●

相鄰兩個(gè)氨基酸的

-carbon在對角

(trans)，反式C肽鍵的特點(diǎn)sp2sp2●

肽鍵亞氨基在pH0-14內(nèi)不解離。第10頁/共70頁P(yáng)ro形成的肽鏈肽平面是可以反式也可以順式。第11頁/共70頁兩肽鍵

平面的交接點(diǎn)為

a-碳以肽鍵平面連接成多肽長鏈注意

a-碳上面接有各種大小不等的基團(tuán)Mathewsetal(2000)Biochemistry(3e)p.136第12頁/共70頁多肽鏈可以看成由Ca串聯(lián)起來的數(shù)個(gè)肽平面組成氨基酸殘基氨基酸殘基第13頁/共70頁1、

旋光性一般短肽的旋光度等于其各個(gè)氨基酸的旋光度的總和。2、

肽的酸堿性質(zhì)短肽在晶體和水溶液中是以偶極離子形式存在。肽的酸堿性質(zhì)主要取決于N端a-NH２和C端a-COOH以及側(cè)鏈R上可解離的基團(tuán)。在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。三、肽的物理化學(xué)性質(zhì)第14頁/共70頁pH優(yōu)勢離子的凈電荷：

<3.5+23.5-4.6+14.6-7.807.8-10.2-1>10.2-2等電點(diǎn)：3、肽的等電點(diǎn)：第15頁/共70頁肽的a-羧基，a-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)NH2-CO-NH-CO-NH2(雙縮脲），能與CuSO4-NaOH產(chǎn)生顏色反應(yīng)（紫紅或藍(lán)紫色）。凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無此反應(yīng)。4、肽的化學(xué)反應(yīng)第16頁/共70頁1、

谷胱甘肽（GSH）三肽（Glu-Cys-Gly），廣泛存在于生物細(xì)胞中，含有自由的巰基，具有很強(qiáng)的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護(hù)某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。四、天然存在的活性肽GluCysGlyg-肽鍵第17頁/共70頁abg第18頁/共70頁2.促甲狀腺素釋放激素：三肽（焦谷氨酰組氨酰脯氨酸），可促進(jìn)甲狀腺素的釋放。

3.短桿菌素S：環(huán)十肽，含有D-苯丙氨酸、鳥氨酸，對革蘭氏陰性細(xì)菌有破壞作用，主要作用于細(xì)胞膜。

4.青霉素：含有D—半胱氨酸和D—纈氨酸的二肽衍生物。主要破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁粘肽的合成引起溶菌。

第19頁/共70頁5.牛催產(chǎn)素與加壓素：均為九肽7.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用。6.舒緩激肽：促進(jìn)血管舒張，促進(jìn)水、鈉離子的排出。第20頁/共70頁腦啡與其受體結(jié)合后可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果麻啡可以模擬腦啡的作用，因此有類似的效用第21頁/共70頁H3N+–CH–C–N–CH–C–O–CH3COO-CH2OOCH2HL-Aspartyl-L-phenylalaninemethylesterAspartameCampbell(1999)Biochemistry(3e)p.95阿斯巴甜第22頁/共70頁第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)Thestructureofproteins一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)四、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)第23頁/共70頁一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸四級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)第24頁/共70頁一級(jí)結(jié)構(gòu)（共價(jià)結(jié)構(gòu)）：蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（初級(jí)結(jié)構(gòu)）Primarystructure（一）、一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究內(nèi)容與研究意義研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，主要研究內(nèi)容：1、氨基酸是如何連接成蛋白質(zhì)，2、對于一定的蛋白質(zhì),氨基酸的排列順序。3、蛋白質(zhì)r的一級(jí)結(jié)構(gòu)測定過程。第25頁/共70頁意義：1、研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，這是因?yàn)镻r的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了它的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而決定了蛋白質(zhì)的生物功能。2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究為生物進(jìn)化提供了依據(jù)，不同生物的同一種蛋白的其一級(jí)結(jié)構(gòu)是不同的。3、一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究為一些分子病的診斷提供了依據(jù)。

只有將蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)研究清楚后，生化工作者才能站到一個(gè)優(yōu)越的地位去洞察，研究生命過程中的許多復(fù)雜問題。第26頁/共70頁F.Sanger

(1951,CambridgeU)

Insulin胰島素

(A,Bchains)Nelson&Cox(2000)PrinciplesofBiochemistry(3e)p.142SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT

B-chain

A-chain（二）、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定第27頁/共70頁階段一：測序前的準(zhǔn)備工作1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定程序(1).確定蛋白質(zhì)不同多肽鏈的數(shù)目

(2).拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈，打開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵(3).分離純化各自不同的多肽鏈(4).確定各多肽鏈的氨基酸組成分離提純蛋白質(zhì)，測定蛋白質(zhì)的分子量第28頁/共70頁階段二：多肽鏈的測序1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定程序(1).特異性打斷多肽鏈，產(chǎn)生適合測序大小的肽段(2).分離純化肽段(3).確定每一肽段的氨基酸順序(4).采用另一種特異性試劑將多肽鏈打斷,重復(fù)前三步.第29頁/共70頁階段三：氨基酸順序的拼接1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定程序(1).利用重疊拼接法拼接氨基酸順序(2).確定多肽鏈之內(nèi)和之間的二硫鍵的位置.SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT

B-chain

A-chain+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT

B-chain

A-chainCOO-FLYLVCGERGFYTPKTNH3+SFVNQHLCGHLVEA

B-chain第30頁/共70頁N-末端分析

A.化學(xué)法DNS-Cl法：黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。DNFB法：經(jīng)典法，Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機(jī)溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等。PITC法：Edman法，最常用，逐步切下。無色PTH-氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析。

2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定第31頁/共70頁N-末端分析

B.酶法（氨肽酶法）從多肽鏈的N-末端逐個(gè)地向里切。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線。亮氨酸氨肽酶：最常用氨肽酶M：較常用2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定Gly-Ser-Val第32頁/共70頁N-末端分析

C.常見問題及處理方法：2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定

經(jīng)常碰到N-末端殘基的氨基被封閉。因此不能與Edman降解試劑發(fā)生作用。焦谷氨?；?、乙?；约澳承┉h(huán)狀肽。焦谷氨酸氨肽酶第33頁/共70頁②C-末端分析

A.肼解法無水肼NH2NH2

100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游離氨基酸留在上清中。

Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定第34頁/共70頁②C-末端分析

B.還原法,硼氫化鋰(LiBH4)肽-COOH生成肽-CH2OH水解,分離,層析鑒定。此法比較少用。

C.羧肽酶法，（Pro不能測）2、N-末端和C-末端氨基酸殘基的的鑒定羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、LysVal—Ser—Gly第35頁/共70頁

①.多肽鏈之間的連接方式

A.共價(jià)鍵二硫鍵

-S-S-酰胺鍵-CO-NH-酯鍵-CO-O-

B.非共價(jià)鍵氫鍵R……H離子鍵R+……R-疏水作用RR范德華力RR3、肽鏈的分離、純化與測定第36頁/共70頁共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的鍵能鍵長

真空中

水溶液共價(jià)鍵離子鍵氫

鍵范德華力0.15nm0.25nm0.30nm0.35nm908040.190310.1kcal/moleAdaptedfromAlbertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.57第37頁/共70頁

②.肽鏈的拆離方法

A.二硫鍵的拆離過甲酸氧化法和巰基化合物（巰基乙醇）還原法。

B.非共價(jià)鍵的拆離8M尿素或6M鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，多肽鏈松散而成無規(guī)則的構(gòu)象。

C.烷基化試劑保護(hù)

如碘乙酸保護(hù)還原-SH，防止重新氧化。3、肽鏈的分離、純化與測定第38頁/共70頁第39頁/共70頁4、肽鏈的部分水解

拆鏈得到的多肽鏈一般是100-1000個(gè)氨基酸，需要將其切成小肽段，分別測定它們的順序，最后連在一起。1、裂解的部位要專一。2、裂解點(diǎn)要少，切的肽段的大小要合適。3、產(chǎn)率要高，要求試劑不能破壞裂解后的肽段。裂解的方法：化學(xué)法，酶學(xué)法第40頁/共70頁①、化學(xué)裂解法

A.溴化氰裂法：專一裂解Met羧基所成的肽鍵4、肽鏈的部分水解第41頁/共70頁甲基硫氰酸第42頁/共70頁①、化學(xué)裂解法

B.羥胺斷裂：專一裂解Asn-Gly之間的肽鍵。4、肽鏈的部分水解專一不很強(qiáng)，Asn-Leu,Asn-Ala鍵也部分裂解由于Asn-Gly出現(xiàn)機(jī)率較低，所以所得片斷較大。第43頁/共70頁②、酶裂解法

A.胰蛋白酶(trypsin)

4、肽鏈的部分水解專一裂解Lys、Arg的羧基參與形成的肽鍵。為了減少的作用位點(diǎn)，可用化學(xué)修飾將多肽鏈側(cè)鏈保護(hù)起來，1.2－環(huán)己酮封閉Arg，馬來酸酐封閉Lys。氮丙啶形成帶正電荷點(diǎn)，增加位點(diǎn)。B.糜蛋白酶(Chymotrypsin)斷裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近的基團(tuán)，堿性：裂解能力↑，酸性：裂解能力↓第44頁/共70頁環(huán)已二酮第45頁/共70頁②、酶裂解法

C.胃蛋白酶(Pepsin)4、肽鏈的部分水解斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性或芳香氨基酸殘基。其后和前為Pro時(shí)抑制。D.嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)疏水、芳香氨基酸殘基氨基端，含Ca，Zn。Phe,Trp,Tyr,Leu,Ile,Val,Met

，羧基是Pro,Gly時(shí)不作用。第46頁/共70頁

②、酶裂解法

Ｅ.金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶），4、肽鏈的部分水解

磷酸緩沖液PH7.8能在Glu殘基和Asn殘基的羧基側(cè)斷裂肽鍵，NH4HCO3緩沖液pH7.8醋酸銨緩沖液PH4.0只能斷裂Glu殘基的羧基側(cè)肽鍵Ｆ.梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶）

專門裂解Arg殘基的COOH所形成的肽鍵,對不溶性蛋白質(zhì)的長時(shí)間裂解很有效。第47頁/共70頁①胰蛋白酶

Lys—X,Arg—X

(X≠Pro)②胰凝乳蛋白酶

Tyr—X，Trp—X,Phe—X(X≠Pro)③胃蛋白酶

Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)④嗜熱菌蛋白酶

X-Phe,Trp,Tyr,Leu,Ile,Val,Met（≠Pro）⑤Glu蛋白酶Glu——X⑥Arg蛋白酶Arg——X酶法裂解總結(jié)第48頁/共70頁①電泳法：SDS

根據(jù)分子量大小分離②離子交換層析法:（DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex）根據(jù)肽段的電荷特性分離③反相HPLC法根據(jù)肽段的極性分離④凝膠過濾要求：SDS—PAGE單帶

HPLC單峰

N端單一（常用DNS－Cl法）5、肽段的分離純化第49頁/共70頁1）、Edman法

（1）耦聯(lián)

PITC＋H２N—A-B-C-DpH9，40℃PTC—A-B-C-D6、肽段序列測定及肽鏈的拼接第50頁/共70頁（2）裂解

無水三氟乙酸（CF3COOH）ATZ—A+H2N—B-C-DCF3COOH

ATZ6、肽段序列測定及肽鏈的拼接第51頁/共70頁（3）轉(zhuǎn)化（ATZ不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化成PTH-aa)ATZPTH—aaPTC肽：苯氨基硫甲酰肽;ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）;PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸）

ATZPTC-aaPTH-aaH2O(1MHCl)6、肽段序列測定及肽鏈的拼接第52頁/共70頁2）、用自動(dòng)序列分析儀測序儀器原理：Edman法。1967液相測序儀：旋反應(yīng)器，適于大肽段。1971固相測序儀：表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。1981氣相測序儀：用Polybrene反應(yīng)器。6、肽段序列測定及肽鏈的拼接第53頁/共70頁第54頁/共70頁3）、肽段拼接成肽鏈16肽，Ｎ端HＣ端Ｓ

Ａ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWT6、肽段序列測定及肽鏈的拼接Ｂ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS第55頁/共70頁一條多肽鏈經(jīng)兩種部分水解的方法得到兩套肽段，經(jīng)測定各肽段的氨基酸順序都已確定，推知整條肽鏈的氨基酸順序。1).溴化氰裂解后的肽段(1).Trp-Ser-Arg-Glu-Hsr(2).Gly-His-Ala-Leu-Lys-Phe-Glu(3).Ala-Gly-Val-Lys-Asp-Hsr(4).Pro-Val-Lys-Ile-Phe-Hsr2).胰蛋白酶裂解后的肽段(1).Ile-Phe-Met-Trp-Ser-Arg(2).Ala-Gly-Val-Lys(3).Asp-Met-Pro-Val-Lys(4).Glu-Met-Gly-His-Ala-Leu-Lys(5).Phe-Glu(3)-(4)-(1)-(2)(2)-(3)-(1)-(4)-(5)第56頁/共70頁根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推斷一條多肽鏈的氨基酸順序.1).酸水解得知氨基酸的組成:2Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;2Ser.2).羧肽酶A水解得:Ala.3).胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸組成如下:(1).Ala;Arg.(2).Lys;Phe;Ser.(3).Lys.(4).Ala;Met;Ser.4).溴化氰裂解得兩個(gè)肽段,其氨基酸組成如下:(1).Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;Ser.(2).Ala;Ser.5).嗜熱菌蛋白酶水解得兩個(gè)肽段,其氨基酸組成如下:(1).Ala;Arg;Ser.(2).Ala;2Lys;Met;Phe;Ser.

Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala第57頁/共70頁第58頁/共70頁測核酸序列推斷氨基酸序列1）酶降解法測序2）質(zhì)譜法測定（蛋白質(zhì)組）p177書3）根據(jù)核苷酸序列的推定法7、其它測序方法第59頁/共70頁

對角