蛋白質(zhì)化學(xué)理化性質(zhì)與分離分析

蛋白質(zhì)化學(xué)理化性質(zhì)與分離分析第1頁/共174頁蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第2頁/共174頁蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及應(yīng)用蛋白質(zhì)分子量大，是一種膠體溶液；具有特定的空間構(gòu)象，分子量一定分子篩層析；在大部分pH條件下，蛋白質(zhì)分子同時存在兩種電荷等電點沉淀，鹽溶，鹽析，電泳，離子交換層析等；一般而言，蛋白質(zhì)分子上同時存在疏水和親水區(qū)域有機溶劑沉淀，疏水層析(反相層析)。第3頁/共174頁蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子量大，介于一萬到百萬之間，故其分子的大小已達(dá)到膠粒1-100nm范圍之內(nèi)。球狀蛋白質(zhì)的表面多親水基團，具有強烈吸引水分子的作用，使蛋白質(zhì)分子表面常為多層水分子所包圍--水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集。與低分子物質(zhì)相比，蛋白質(zhì)分子擴散速度慢，不易透過半透膜，粘度大，在分離提純蛋白質(zhì)過程中，可以利用蛋白質(zhì)的這一性質(zhì)，將混有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液置于半透膜制成的透析袋或管內(nèi)，浮于流動水或適宜的緩沖液中，小分子雜質(zhì)皆易從袋中透出，保留了比較純的蛋白質(zhì)--透析(dialysis)。第4頁/共174頁顆粒大小：在1-100nm之間，屬膠體，因此溶于水，成為親水膠體。

穩(wěn)定親水膠體的因素：

水化膜

表面電荷相同不通透性：半透膜(semipermeablemembrane)蛋白質(zhì)溶液是一種分散系統(tǒng)，蛋白質(zhì)分子顆粒是分散相，水是分散介質(zhì)。分散相質(zhì)點小于1nm為真溶液，大于100nm為懸濁液，介于1-100nm為膠體溶液。第5頁/共174頁透析即用半透膜（透析袋）將大分子蛋白質(zhì)分離出來。在生物大分子制備過程中除去鹽、少量有機溶劑、生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品，透析法最簡便。透析時，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二邊溶液濃度差產(chǎn)生的擴散壓作用下滲過透析膜，其速度與濃度梯度、膜面積及溫度成正比。欲快速透析可采用直徑較小的透析袋以增加膜面積。常用溫度：4℃，升溫、更換袋外透析液或用磁力攪拌器，均能提高透析速度。

MWCO:molecularweightcut-off第6頁/共174頁第7頁/共174頁疏水區(qū)域蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)第8頁/共174頁

蛋白質(zhì)大分子溶液在一定溶劑中超速離心時可發(fā)生沉降。沉降速度與向心加速度之比值即為蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)S。

s=v/ω2r

s是沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient)，ω是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。沉降系數(shù)以每單位重力的沉降時間表示，蛋白質(zhì)、核酸、核糖體、病毒等的沉降系數(shù)通常為1-200×10-13秒范圍，10-13這個因子叫做沉降單位S（斯維德貝格單位，Svedbergunit），即1S=10-13秒，如血紅蛋白的S約為4×10-13秒或4S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。第9頁/共174頁1924年Svedberg（離心法創(chuàng)始人--瑞典蛋白質(zhì)化學(xué)家）對沉降系數(shù)的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。第10頁/共174頁蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點

蛋白質(zhì)由氨基酸組成，分子中除兩端的游離氨基和羧基外，側(cè)鏈上還有一些解離基團，如Glu、Asp殘基中的γ和β-羧基，Lys殘基中的ε-氨基，Arg殘基的胍基和His的咪唑基。作為帶電顆粒，可以在電場中移動，移動方向取決于蛋白質(zhì)分子所帶的電荷性質(zhì)。蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液pH影響。當(dāng)處于某一pH時，蛋白質(zhì)兼性離子(zwitterion)的凈電荷為0，此時溶液的pH值為蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint，pI)。處于等電點的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不移動。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。溶液中的蛋白質(zhì)顆粒pH=pI時，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子在電場中不移動。

pH＞pI時，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為負(fù)，蛋白質(zhì)分子在電場中向陽極移動。

pH＜pI時，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為正，蛋白質(zhì)分子在電場中向陰極移動。在pI時，蛋白質(zhì)失去了膠體的穩(wěn)定條件，即沒有相同電荷相互排斥的作用，所以不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀。第12頁/共174頁蛋白質(zhì)在等電點時的溶解度最小pH與鹽濃度對蛋白質(zhì)溶解度的共同作用第13頁/共174頁蛋白質(zhì)的變性(Denaturation)

天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，如酶失去催化活力、激素喪失活性，即蛋白質(zhì)的變性作用(denaturation)。變性只是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的破壞，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)是次級鍵、二硫鍵的破壞，并不涉及一級結(jié)構(gòu)的變化。第14頁/共174頁引起蛋白質(zhì)變性的因素

引起蛋白質(zhì)變性的原因可分為物理和化學(xué)因素兩大類。物理因素可以是加熱、加壓、脫水、攪拌、振蕩、紫外線照射、超聲波的作用等；化學(xué)因素有強酸、強堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)等。在臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用于消毒及滅菌。反之，注意防止蛋白質(zhì)變性就能有效地保存蛋白質(zhì)制劑。第15頁/共174頁

在變性因素的作用下，可導(dǎo)致各種變性現(xiàn)象。首先是生理活性喪失，如酶變性后，失去催化功能；激素變性后，失去生理調(diào)節(jié)功能；微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性后，微生物失去生命力而死亡。這是變性作用最主要的特征。此外，變性后的蛋白質(zhì)還表現(xiàn)出各種物理和化學(xué)性質(zhì)的改變。天然蛋白質(zhì)變性后，多肽鏈松弛伸展，導(dǎo)致粘度增大，內(nèi)部的側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F暴露于表面，導(dǎo)致溶解度下降而易沉淀。同時由于變性后，結(jié)構(gòu)松散，側(cè)鏈基團暴露，還使得其易于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，例變性蛋白質(zhì)容易被酶水解。由于疏水側(cè)鏈暴露，可能導(dǎo)致紫外吸收增加。第16頁/共174頁第17頁/共174頁變性與復(fù)性

變性并非完全是不可逆的變化，當(dāng)變性程度較輕時，去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱為復(fù)性(renaturation)。如核糖核酸酶中四對二硫鍵及其氫鍵，在β-巰基乙醇和8M尿素作用下，發(fā)生變性，失去生物學(xué)活性，變性后如經(jīng)過透析去除尿素，β-巰基乙醇，并對空氣緩慢氧化使疏基氧化成二硫鍵，酶蛋白又可恢復(fù)其原來的構(gòu)象，酶學(xué)活性也幾乎全部恢復(fù)，稱為變性核糖核酸酶的復(fù)性。許多蛋白質(zhì)變性時被破壞嚴(yán)重，即使撤去變性因素也不能恢復(fù)，稱為不可逆性變性。第18頁/共174頁RNase的變性與復(fù)性第19頁/共174頁鹽析(SaltingOut)

在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對混和蛋白質(zhì)組分的分離。例如用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來，鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。第20頁/共174頁蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度（硫酸銨濃度）鹽析鹽溶第21頁/共174頁蛋白質(zhì)的沉淀(Precipitation)

蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象-蛋白質(zhì)沉淀，變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有兩種穩(wěn)定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無外加條件，不致互相凝集。然而除掉這兩個穩(wěn)定因素(如調(diào)節(jié)溶液pH至pI和加入脫水劑)，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。但如將溶液pH調(diào)節(jié)到蛋白質(zhì)pI，蛋白質(zhì)分子呈等電狀態(tài)，雖然分子間同性電荷相互排斥作用消失了。但是還有水化膜起保護(hù)作用，一般不致于發(fā)生凝聚作用，如果這時再加入某種脫水劑，除去蛋白質(zhì)分子的水化膜，則蛋白質(zhì)分子就會互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白質(zhì)脫水，然后再調(diào)節(jié)pH到等電點，也同樣可使蛋白質(zhì)沉淀析出。第22頁/共174頁+++++++-------+-蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀（沉淀）（疏水膠體）（疏水膠體）第23頁/共174頁重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成鹽沉淀，沉淀的條件以pH稍大于等電點為宜。因為此時蛋白質(zhì)分子有較多的負(fù)離子，易與重金屬離子結(jié)合成鹽。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的，但若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。臨床上利用蛋白質(zhì)能與重金屬鹽結(jié)合的這種性質(zhì)，搶救誤服重金屬鹽中毒的病人，給病人口服大量蛋白質(zhì)，然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬鹽嘔吐出來解毒。第24頁/共174頁生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，沉淀的條件應(yīng)當(dāng)是pH小于等電點，這樣蛋白質(zhì)帶正電荷易于與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。臨床血液化學(xué)分析時常利用此原理除去血液中的蛋白質(zhì)，此類沉淀反應(yīng)也可用于檢驗?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。第25頁/共174頁有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)

可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點時使蛋白質(zhì)沉淀。在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進(jìn)行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。第26頁/共174頁不可逆沉淀指沉淀出來的蛋白質(zhì)分子，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變，蛋白質(zhì)已失去了原來的生物活性，即使沉淀因素消失，沉淀也不重新溶解。在蛋白質(zhì)溶液中加入某些水溶性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等，由于這些溶劑與水的親和力大于蛋白質(zhì)，破壞了蛋白質(zhì)膠體外層的水化膜，并可逐步進(jìn)入蛋白質(zhì)的內(nèi)部，有利于蛋白質(zhì)的沉淀，此種作用在短時間及低溫時，沉淀是可逆的，但作用時間長或溫度較高時，則是不可逆沉淀。第27頁/共174頁三氯乙酸、苦味酸、磷鎢酸、鞣酸等生物堿沉淀試劑，能與蛋白質(zhì)陽離子結(jié)合生成不溶物,而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。如：

+H3N-Pr-COO-+Cl3C-COO-

[H2N-Pr-COO-]O-CO-CCl3↓Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等重金屬陽離子，能與蛋白質(zhì)陰離子結(jié)合生成不溶物，使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。例如：

H2N-Pr-COO-+Ag+

H2N-Pr-COOAg↓第28頁/共174頁加熱凝固(Coagulation)

將接近于等電點附近的蛋白質(zhì)溶液加熱，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉淀。加熱首先使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的肽鏈結(jié)構(gòu)被打開呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對稱性增加，疏水基團暴露，進(jìn)而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。蛋白質(zhì)的變性、沉淀、凝固之間有密切的關(guān)系。但蛋白質(zhì)變性后并不一定沉淀，變性蛋白質(zhì)只在等電點附近才沉淀，沉淀的變性蛋白質(zhì)也不一定凝固。如蛋白質(zhì)被強酸、強堿變性后由于蛋白質(zhì)顆粒帶有大量電荷，仍溶于強酸或強減之中。但若將強堿或強酸溶液的pH調(diào)節(jié)到pI，則變性蛋白質(zhì)凝集成絮狀沉淀物，若將此絮狀物加熱，則分子間相互盤纏而變成較為堅固的凝塊。

第29頁/共174頁蛋白質(zhì)的紫外吸收波長：280nm引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸(Trp）和酪氨酸（Tyr)的共軛雙鍵，Phe在紫外光區(qū)也有光吸收。可用于蛋白質(zhì)的定量測定。第30頁/共174頁波長范圍：200-400nm第31頁/共174頁第32頁/共174頁蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)I

1.

雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色，稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個以上－CO－NH－鍵的化合物都呈此反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中氨基酸是以肽鍵相連，因此所有蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。

2.米倫反應(yīng)(millonreaction)，蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)榧t色沉淀，此為酪氨酸的酚核所特有的反應(yīng)，因此含有酪氨酸的蛋白質(zhì)均呈米倫反應(yīng)（5mg/mL）。第33頁/共174頁 3.茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)，α－氨基酸與水合茚三酮(苯丙環(huán)三酮戊烴)作用時，產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)是由許多α－氨基酸組成的，所以也呈此顏色反應(yīng)。

4.黃蛋白反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中若存在含有苯環(huán)的氨基酸（如Tyr、Phe等），當(dāng)其與硝酸共熱時，則呈黃色，再加堿則顏色變?yōu)槌赛S。這一反應(yīng)稱為黃蛋白反應(yīng)。一般蛋白質(zhì)常含有Tyr和Phe殘基，因此這一反應(yīng)是蛋白質(zhì)較為普遍的顏色反應(yīng)。蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

II

第34頁/共174頁 5.含硫蛋白質(zhì)的反應(yīng)，如果蛋白質(zhì)分子中含有Cys或Met殘基，當(dāng)與堿及醋酸鉛共熱時，分解產(chǎn)生的硫遇鉛鹽即產(chǎn)生黑色的硫化鉛沉淀。

6.色氨酸反應(yīng)，將蛋白質(zhì)溶液與幾滴乙醛酸混合后，再沿器壁慢慢加入濃硫酸，如果蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈中有吲哚環(huán)，則兩液層的界面上會出現(xiàn)紫色環(huán)，這個反應(yīng)稱為色氨酸反應(yīng)，又稱為乙醛酸反應(yīng)或霍普金（Hopking）反應(yīng)?？捎脕頇z驗蛋白質(zhì)或肽的分子中是否有Trp殘基。蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)III第35頁/共174頁蛋白質(zhì)定性定量分析第36頁/共174頁蛋白質(zhì)的定量測定

一般說來，動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品，以下幾種食品的蛋白質(zhì)含量大約為：

牛肉20.0%

豬肉9.5%兔肉21%雞肉20%

牛乳3.5%

帶魚18.0%

大豆40%

面粉9.9%

菠菜2.4%黃瓜1.0%蘋果1.4%

測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。第37頁/共174頁蛋白質(zhì)分子量的測定方法超離心法凝膠過濾SDS－PAGE法光散射法滲透壓法激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(LDI-TOF-MS)第38頁/共174頁1、根據(jù)化學(xué)組成測定最低分子量

用化學(xué)分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，并假設(shè)分子中只有一個這種元素的原子，就可以計算出蛋白質(zhì)的最低分子量。

如肌紅蛋白含鐵0.335%，其最低分子量：

最低分子量＝鐵的原子量÷鐵的百分含量×100=16700 與其他方法測定結(jié)果極為接近，可見肌紅蛋白中只含一個鐵原子。真實分子量是最低原子量的n倍，n是蛋白質(zhì)中鐵原子的數(shù)目，肌紅蛋白n＝1。

血紅蛋白鐵含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因為含4個鐵原子，所以n＝4，因此其真實分子量為66800。

有時蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸含量很少，也可用這種方法計算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量為35200，用其他方法測得分子量為69000，所以其分子中含兩個色氨酸。最低分子量只有與其他方法配合才能確定真實分子量。第39頁/共174頁2、滲透壓法

理想溶液中，滲透壓是濃度的線性函數(shù)，而與溶質(zhì)的形狀無關(guān)。所以可用滲透壓計算蛋白質(zhì)的分子量。但是實際的高分子溶液與理想溶液有較大偏差，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度不大時，可用以下公式計算：

/c=RT/M+KcM=RT/lim(/c)

其中R是氣體常數(shù)(0.082)，T是絕對溫度，

是滲透壓（以大氣壓計），c溶質(zhì)濃度（g/L）。測定時需測定幾個不同濃度的滲透壓，以/c對c作圖并外推求出c為零時的/c值，帶入公式求出分子量（1-100000）。

方法簡單準(zhǔn)確，與蛋白質(zhì)的形狀和水化程度無關(guān)，但要求樣品均一，否則測定結(jié)果是樣品中各種蛋白的平均分子量。c→0第40頁/共174頁3、沉降分析法

蛋白質(zhì)在溶液中受到強大離心力作用時，如其密度大于溶液密度，就會沉降。用超速離心機（每分鐘6－8萬轉(zhuǎn)）測定蛋白質(zhì)的分子量有兩種方法：沉降速度法和沉降平衡法。沉降速度法：

M=RTs÷D(1－vρ)

其中D是擴散系數(shù)，v是蛋白質(zhì)的偏微分比容，ρ是溶劑的密度。偏微分比容的定義是：當(dāng)加入1克干物質(zhì)于無限大體積的溶劑中時，溶液的體積增量。蛋白質(zhì)溶于水的偏微分比容約為0.74立方厘米每克。為獲得準(zhǔn)確結(jié)果，s和D的值應(yīng)外推到無限稀釋。其中的R是氣體常數(shù)，在采用厘米.克.秒制時，等于8.314×107爾格/秒。第41頁/共174頁沉降平衡法

在離心過程中，外圍高濃度區(qū)的蛋白質(zhì)向中心擴散，如轉(zhuǎn)速較低，二者可達(dá)到穩(wěn)定平衡。此時測定離心管中不同區(qū)域的蛋白濃度，可按下式計算分子量：

M=2RTln(c2/c1)÷[ω2(1－vρ)(x22－x12)]

其中c2和c1是離軸心距離為x2和x1時的蛋白質(zhì)濃度，x為蛋白質(zhì)界面到旋轉(zhuǎn)中心的距離，為溶劑的密度，為角速度，v為蛋白質(zhì)的偏微比容。沉降平衡法的優(yōu)點是不需要擴散系數(shù)，且離心速度較低（8000－20000轉(zhuǎn)每分），但要達(dá)到平衡常常需要幾天時間。第42頁/共174頁4、分子排阻層析法

層析柱中填充凝膠顆粒，凝膠的網(wǎng)格大小可通過交聯(lián)劑含量控制。小分子物質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)格中，流出慢；大分子被排阻在顆粒外，流經(jīng)距離短，流出快。此方法較簡單，但與分子形狀有關(guān)。測分子量時，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子形狀應(yīng)與待測蛋白相同。

lgM＝K1－K2Ve

其中Ve是洗脫體積，即從加樣到出峰時流出的體積，K1和K2是常數(shù)，隨實驗條件而定。先測定幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve,以它們的logM對Ve作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由待測樣品的Ve可求得。第43頁/共174頁第44頁/共174頁5、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

蛋白質(zhì)電泳時的遷移率與其所帶凈電荷、分子大小和形狀有關(guān)，加入SDS后，每克蛋白可結(jié)合1.4克SDS，將原有電荷掩蓋，而且使分子變成棒狀。由于凝膠的分子篩效應(yīng)，相對遷移率μR與分子量有如下關(guān)系：

lgM=K1－K2μR

其中K1和K2是與試驗條件有關(guān)的常數(shù)，μR為相對遷移率=樣品遷移距離/染料前沿遷移距離。用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出未知蛋白的分子量。有些蛋白不適宜采用這個方法，如帶電荷較多的（組蛋白），帶較大輔基的（糖蛋白），結(jié)構(gòu)特殊的（膠原）等。第45頁/共174頁第46頁/共174頁6、激光解吸電離飛行時間曲線(LDI-TOF-MS)高度純化的蛋白質(zhì)樣品與有機酸混合，在靶金屬表面干燥；激光發(fā)出的射線使蛋白質(zhì)離子化，離子經(jīng)加速后飛入自由漂移區(qū)，最后到達(dá)檢測器；飛行時間與分子量成反比，與電量成正比；測定誤差0.0001。第47頁/共174頁蛋白質(zhì)的定量測定法凱（克）氏(Kjeldahl)定氮法:

濃硫酸加熱降解蛋白質(zhì)后測定NH3雙縮脲(biuret)法:

CuSO4與肽鏈的氨基結(jié)合Folin-Phenol法:

芳香族氨基酸側(cè)鏈發(fā)色紫外法:

280nm處的紫外吸收(1OD280=1mg/ml)Bradford法:

考馬斯亮蘭(Coomassie brilliantblueG250)與肽鏈結(jié)合后吸收譜變化BCA(bicinchoninicacid)法:

FDA唯一認(rèn)可第48頁/共174頁凱（克）氏定氮法

蛋白質(zhì)的含氮量一般為15-17%，有上下浮動的差別，可以測出總氮(N)

=N×6.25=蛋白質(zhì)含量

1833年，由Kieldhl提出定氮法，現(xiàn)已發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。第49頁/共174頁常量凱氏定氮法原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨，與硫酸結(jié)合成硫酸銨；然后加堿蒸餾，使氨蒸出。①用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含量。②也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。整個過程分為：消化、蒸餾、吸收與滴定。第50頁/共174頁第51頁/共174頁

微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點：加入硼酸量由50ml10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。第52頁/共174頁微量凱氏定氮蒸餾裝置第53頁/共174頁自動凱氏定氮法原理及適用范圍同前特點：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗洠?2分鐘完成1個樣品的測定。第54頁/共174頁1.測定范圍：0.1-200mg氮

2.蒸餾時間：3.5分鐘/樣品（30mg氮）

3.蒸餾能力：~40ml/分鐘

4.滴定精度：3.8ul/步，最快40ml/分鐘

5.重現(xiàn)性：1%相對誤差（包括消化過程）

6.回收率：>99.5%（1-200mg氮）

7.數(shù)據(jù)存儲：400個樣品

8.試管排空：200ml在2秒內(nèi)完成

9.試劑泵體積：0-150ml，10ml/級Kjeltec2300自動凱氏定氮儀丹麥

第55頁/共174頁雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2＋形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)，因此被廣泛地應(yīng)用。在一定的實驗條件下，未知樣品的溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時反應(yīng)，并于540-560nm下比色測定光密度（OD或A），可以通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液可以用結(jié)晶的牛（或人）血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。第56頁/共174頁雙縮脲法原理：脲（尿素）NH2—CO—NH2

加熱至150~160℃時，兩分子縮合成雙縮脲。 雙縮脲能與堿性硫酸銅溶液生成紫紅（或藍(lán)紫）色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵—CO—NH—，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量（560nm）。NH2—CO—NH—CO—NH2

+NH3NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2第57頁/共174頁雙縮脲的形成及與堿性銅顯色第58頁/共174頁Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量 Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin酚試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5-100μg蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。也稱改良Lowry法。第59頁/共174頁紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量大多數(shù)蛋白質(zhì)由于有Trp和Tyr的存在，在紫外280nm有吸收高峰，以此可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。通常以濃度1mg蛋白質(zhì)/ml溶液的A280為1.0進(jìn)行估算。若已知該蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)值，可直接計算出樣品溶液中蛋白質(zhì)的濃度。

蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)=1.45A280-0.74A260(假設(shè)1mg蛋白質(zhì)/ml溶液的A280為1.0)蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=1.55A280-0.76A260215nm和225nm的吸收差法，蛋白質(zhì)的肽鍵在200-250nm有強的紫外光吸收，其光吸收強弱在一定范圍內(nèi)與濃度成正比，且波長越短光吸收越強。蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=0.144(A215-A225)(測定范圍為20-100μg蛋白質(zhì)/ml)第60頁/共174頁蛋白質(zhì)紫外吸收定量計算光吸收值A(chǔ)的Beer-Lambert公式:

A=kcl=log(Io/I)=-logT

T(透光率,%)=

I/Io;

k-消光系數(shù)，c-摩爾濃度，

l-樣品池長度;

I-光強度

對混合蛋白質(zhì)樣品,1OD280nm≈1mg/ml對特定蛋白質(zhì)的光吸收值的理論值:

A280(1mg/mL)=(5690Nw+1280Ny+120Nc)/M

Nw,Ny和Nc分別為Trp、Tyr和Cys的數(shù)量,

M為分子量Scopes的經(jīng)驗公式:A2051

mg/ml

=27+120(A280/A205)蛋白質(zhì)也可以下列經(jīng)驗公式定量:

Proteinconcentration(ug/ml)=144(A215

-A225)有核酸混入時,

有三種近似計算法:

Proteinconcentration(mg/ml)=1.55A280-0.76A260Proteinconcentration(mg/ml)=(A235-A280)/2.51Proteinconcentration(mg/ml)=0.813A230-0.0758A260TheProteinProtocolsHandbook,byJohnM.Walker,HumanaPress.第61頁/共174頁BCA法測定蛋白質(zhì)濃度

堿性溶液中，蛋白質(zhì)將二價銅(Cu2+)還原成一價銅(Cu+)，后者與測定試劑中BCA[bicinchoninicacid，雙辛丹寧](金雞寧)生成一個在562nm處具有最大光吸收的紫色復(fù)合物。復(fù)合物的光吸收強度與蛋白質(zhì)濃度正比。此法測定范圍100-1200μg蛋白質(zhì)/ml。BCA法操作簡單，靈敏度雖與Folin-酚法相似，但它的試劑十分穩(wěn)定，因此對時間控制不需那么嚴(yán)格。顯色后，1h內(nèi)讀A562值無變化，抗試劑干擾的能力強。第62頁/共174頁考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度

（Coomassiebrilliantblue,CBB） 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法-Bradford法，根據(jù)蛋白質(zhì)與CBB結(jié)合的原理設(shè)計。這種測定法具有超過其他幾種方法突出的優(yōu)點，得到廣泛的應(yīng)用。是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。CBBG-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

第63頁/共174頁Bradford法測定蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）靈敏度高，最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1ug。

（2）快速、簡便，只需加一種試劑。（3）干擾物質(zhì)少。缺點：

（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。第64頁/共174頁蛋白質(zhì)的分離純化第65頁/共174頁蛋白質(zhì)分離純化的一般原則純化蛋白質(zhì)（酶）的最終目標(biāo)：增加純度或比活性，并使產(chǎn)量達(dá)到最高值。

前處理（提?。┐址旨墸ǔ跆峒儯┘?xì)分級

（精純化）第66頁/共174頁蛋白質(zhì)分離純化的基本原則選擇好的材料摸清目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性探索有效的抽提法和濃縮法建立一套層析的組合以較好的方法貯存第67頁/共174頁

初提精純化鹽析?離子交換層析有機溶劑沉淀?分子篩層析等電點沉淀?疏水/反相層析結(jié)晶?親和層析蛋白質(zhì)分離純化的具體方法第68頁/共174頁第69頁/共174頁必須分離和純化蛋白質(zhì)研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)、功能、氨基酸組成及序列測定，必須制備純的蛋白質(zhì)。一個細(xì)胞含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)，如何由其中分離獲得其中的某個蛋白質(zhì)？分離純化蛋白質(zhì)的方法利用了不同蛋白質(zhì)分子之間不同的理化性質(zhì)，如：許多蛋白質(zhì)能高特異性地與其他生物分子結(jié)合，這些蛋白質(zhì)的分離純化就可以利用這一特性。第70頁/共174頁第71頁/共174頁破碎細(xì)胞及離心

蛋白質(zhì)的來源通常是生物組織或微生物細(xì)胞。分離純化的第一步是要破碎這些細(xì)胞，將其中的蛋白質(zhì)釋放到溶液中—粗提液(crudeextract)。如果需要，可以用不同的離心力對樣品進(jìn)行離心，制備亞細(xì)胞組分或分離特定的細(xì)胞器。細(xì)胞器如核、線粒體、溶酶體等，它們大小不同，離心時的沉降速度不同，在不同的密度梯度中由于不同的比重，浮沉的位置不同。不同的離心可以獲得不同的組分。第72頁/共174頁SubcellularFractionationofTissueFractionationIsopycnicCentrifugation等密度（梯度）離心第73頁/共174頁分部分離(Fractionation)

一旦完成提取物粗抽提或細(xì)胞器的制備，多種方法可以用于純化其中的蛋白質(zhì)。通常，利用蛋白質(zhì)的大小或帶電特性將混合物中的蛋白質(zhì)分離成不同的組分—分部分離。早期純化的分部分離利用蛋白質(zhì)的溶解度的不同，其中涉及pH、溫度、鹽濃度及其他因素。通常蛋白質(zhì)在高鹽濃度下的溶解度降低—鹽析(saltingout)，在蛋白質(zhì)溶液中增加鹽，可以在一些蛋白質(zhì)處于溶解時選擇性地沉淀一些蛋白質(zhì)。由于高的水溶性，硫酸銨[(NH4)2SO4]常被用于這一過程。第74頁/共174頁沉淀蛋白質(zhì)的方法：鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法重金屬鹽沉淀法生物堿試劑和某些酸類沉淀法加熱變性沉淀法第75頁/共174頁蛋白質(zhì)混合物的分離方法利用溶解度差別的分離方法根據(jù)分子大小不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離方法蛋白質(zhì)與其它化合物的專一或非專一相互作用第76頁/共174頁利用溶解度差別的分離方法1.等電點沉淀：（isoelectricprecipitation）2.蛋白質(zhì)的鹽溶（saltingin）和鹽析（saltingout）3.有機溶劑分級法4.溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響第77頁/共174頁根據(jù)分子大小不同的分離方法透析（dialysis）和超(過)濾（ultrafiltration）：密度梯度（區(qū)帶）離心：凝膠過濾層析（分子排阻層析、分子篩層析、凝膠滲透層析）（gelfiltration，GF）

：第78頁/共174頁第79頁/共174頁透析（Dialysis）

含有目的蛋白質(zhì)的溶液在進(jìn)一步純化前需作進(jìn)一步的處理，如透析，利用蛋白質(zhì)分子較大的特性將蛋白質(zhì)從溶劑分離。將部分純化的蛋白質(zhì)溶液裝在一個半透膜的袋子或管子中，當(dāng)裝有樣品的透析袋懸浮于一定離子強度的大體積的緩沖液（透析液）中，半透膜允許鹽及緩沖液發(fā)生交換，但蛋白質(zhì)不能透過，這樣蛋白質(zhì)樣品被保留在袋或管內(nèi)，樣品中的鹽或其它溶質(zhì)可以透過膜進(jìn)行動態(tài)平衡交換，多次調(diào)換透析液可使樣品中的多數(shù)鹽被稀釋。常被用于去除蛋白質(zhì)樣品中的硫酸銨—脫鹽（去鹽）。第80頁/共174頁透析（dialysis）第81頁/共174頁第82頁/共174頁超濾（Ultrafiltration)利用超濾膜在壓力下使大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法叫超濾。超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。第83頁/共174頁超速離心（Ultracentrifugation）不同蛋白質(zhì)的密度與形態(tài)各不相同，在離心力場中沉降的速度也不同，從而將其分離。蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)（S）表示。大體上S與蛋白質(zhì)分子量成正比關(guān)系。S與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)，如分子量相同，緊密顆粒的摩擦系數(shù)小－沉降快；而疏松顆粒的摩擦系數(shù)大－沉降慢。應(yīng)用：蛋白質(zhì)的分離純化和分子量測定。第84頁/共174頁Ultracentrifugation第85頁/共174頁第86頁/共174頁第87頁/共174頁第88頁/共174頁蛋白質(zhì)的分離與分析-層析(Chromatography)第89頁/共174頁蛋白質(zhì)分離純化中常用的層析分子篩層析離子交換層析疏水/反相層析親和層析物理吸附層析利用分子量差異利用電荷差異利用親疏性差異利用特異性親和利用非特異性吸附第90頁/共174頁什么是層析-chromatographyMarch21,1903,MeetingoftheWarsawSocietyofNaturalScientists,MikhailSemenovichTswettpresentedalectureentitled"OnaNewCategoryofAdsorptionPhenomenaanditsApplicationinBiochemicalAnalysis".

第91頁/共174頁

□□□□■□□□□□□□□□■■□□□□□□□■■■■□□□↓□□□□□■■■■■■■■■■■■■■□□□□■□□□□□□□□□■■□□□□□□□■■■■□□□↓□□□□□■■■■■■■■■■■■■■Martin&Synge的逆流分配模型K=1/3K=2/3

1952年獲獎第92頁/共174頁

如陽離子交換層析，固體填料上帶負(fù)電荷，流動相中帶凈正電荷的蛋白質(zhì)與帶凈負(fù)電荷的蛋白質(zhì)相比流得更慢，前者因為與固定相電荷的作用受到更大的阻滯。兩種不同類型的蛋白質(zhì)可以被分離成明顯的兩個帶。蛋白質(zhì)樣品在流動相中的擴展受到分離蛋白質(zhì)不同性質(zhì)的影響及擴散的影響。當(dāng)柱長增加時，帶有不同凈電荷的兩類蛋白質(zhì)的分辨率增加。然而柱長增加通常會引起樣品流速的降低，樣品流經(jīng)柱的時間長度增加，擴散作用會引起分辨率的下降。第93頁/共174頁離子交換層析第94頁/共174頁第95頁/共174頁離子交換層析原理第96頁/共174頁

分子排阻層析(size-exclusionchromatography)，也稱凝膠過濾(gelfiltration)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離。柱料是具有特定孔徑大小的交聯(lián)聚合物。由于較大分子的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入柱料的微孔內(nèi)部，，流經(jīng)柱的直接路徑短，因而比較小分子蛋白質(zhì)的移動速度快而先被洗脫出來；較小分子的蛋白質(zhì)進(jìn)入微孔內(nèi)部，因相對較長的流經(jīng)距離而移動得慢而后被洗脫。第97頁/共174頁Gelfiltrationchromatography第98頁/共174頁第99頁/共174頁第100頁/共174頁親和層析(affinitychromatography)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的結(jié)合特性分離蛋白質(zhì)。滯留在柱料上的蛋白質(zhì)是能特異性與柱料表面交聯(lián)的配體結(jié)合的蛋白質(zhì)。非結(jié)合的蛋白質(zhì)在平衡過程被洗掉，結(jié)合到柱上的目的蛋白質(zhì)用含有游離配體的溶液洗脫下來。第101頁/共174頁

親和層析需要有共價交聯(lián)在層析填料上的生物配體，交聯(lián)的配體必需與目標(biāo)分子間有特異性的親和結(jié)合。非結(jié)合分子被洗去后，結(jié)合在配體上的生物分子必需是可逆的，被競爭洗脫后保持生物活性。第102頁/共174頁HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)

利用高壓泵，加快蛋白質(zhì)分子沿柱流動的速度，提高層析效果，縮短層析時間，消除擴散影響，提高分辨率。 第104頁/共174頁HPLC層析系統(tǒng)泵的結(jié)構(gòu)第105頁/共174頁實驗室用層析柱工業(yè)用層析柱0.5-5cm5-100cm第106頁/共174頁填充物的多孔化可以減少層析壓第107頁/共174頁灌注層析示意第108頁/共174頁

根據(jù)蛋白質(zhì)表面疏水性的不同，利用蛋白質(zhì)和疏水層析介質(zhì)疏水表面可逆的相互作用分離蛋白質(zhì)。 雖然科學(xué)文獻(xiàn)中有些建議，但到目前為止，還沒有被廣泛接受的關(guān)于疏水相互作用層析機制的理論。疏水相互作用層析

（Hydrophobicinteractionchromatography,HIC）第109頁/共174頁反相層析

（ReversePhaseChromatography,RPC）

依賴于洗脫液中樣品分子與介質(zhì)可逆的相互作用。起始條件主要是水相的，有利于高度有序的水結(jié)構(gòu)圍繞著樣品分子。通常一小部分有有機修飾，常用3-5%的乙腈來“造成”濕表面。樣品結(jié)合到填料上，暴露給洗脫液的疏水區(qū)域被最小化，分離依賴于樣品分子在洗脫液中和填料表面達(dá)到的平衡。樣品的分布依賴于填料的性質(zhì)、樣品的疏水性和洗脫液的組成（流動相）。第110頁/共174頁純化工藝中不同層析技術(shù)的組合一般準(zhǔn)則:結(jié)合互補選擇性的技術(shù)，純化工藝應(yīng)盡量采用不同層析技術(shù)(e.g.IEX,HICandGF)減少不同層析技術(shù)間的樣品處理(e.g.濃縮,交換緩沖液)盡量簡單第111頁/共174頁第112頁/共174頁第113頁/共174頁第114頁/共174頁第115頁/共174頁附:ClassificationofChromatography第116頁/共174頁通常一個特定蛋白質(zhì)的分離純化會用到幾種不同手段的組合，每種方法的選擇也是經(jīng)驗性的，在最終確定最有效的方法前需要進(jìn)行多種方法及其組合的嘗試。一般情況會出現(xiàn)以下不同方法的試驗和最終組合。第117頁/共174頁蛋白質(zhì)的分離與分析-電泳(Electrophoresis)第118頁/共174頁蛋白質(zhì)可以通過電泳分離和鑒定

分離蛋白質(zhì)的一個重要技術(shù)（手段）是電泳，利用帶電蛋白質(zhì)在電場中受電場力作用發(fā)生遷移的特性—電泳。電泳通常不用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)純化，因為有更簡單的方法可用，并且電泳會不可逆地導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變。電泳在蛋白質(zhì)及核酸等的分析方法上特別有用。優(yōu)點是蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后可以顯色，研究人員可以很快估測不同蛋白質(zhì)在混合物中的數(shù)量或制備的蛋白質(zhì)的純度；電泳還可以用于測定蛋白質(zhì)的一些性質(zhì)，如等電點及大概的分子量。第119頁/共174頁

蛋白質(zhì)的電泳通常在交聯(lián)的多聚物凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠）上進(jìn)行。聚丙烯酰胺凝膠起著分子篩的作用，能減緩電荷/質(zhì)量比相近蛋白質(zhì)的遷移。待分離物質(zhì)的遷移可能還受分子形狀的影響。電泳中，驅(qū)動大分子運動的力是電勢梯度-E（場強）。分子的電泳遷移率等于粒子的電壓與電場場強的比值，還等于分子的凈電荷Z與摩擦系數(shù)f(frictionalcoefficient)（部分反映蛋白質(zhì)分子的形狀）的比值。=V/E=Z/f因此，蛋白質(zhì)在電場中的電泳遷移是大小和形狀的作用結(jié)果。第120頁/共174頁E.coliRNAPol.第121頁/共174頁

電泳現(xiàn)象早在1809年就已發(fā)現(xiàn)，用于蛋白質(zhì)電泳也有100多年的歷史（1907年）。1937年瑞典的Tiselius因?qū)﹄娪径糠矫娴呢暙I(xiàn)而獲得諾貝爾獎。以后瓊脂電泳和紙電泳技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，并與醫(yī)學(xué)廣泛結(jié)合。在20世紀(jì)60年代凝膠電泳的興起，樹立了電泳史上的一個里程碑，蛋白質(zhì)電泳普及到生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的大部分實驗室。30多年前，現(xiàn)代雙向電泳的出現(xiàn)，奠定了目前蓬勃發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)；20年前，商品化的毛細(xì)管電泳突飛猛進(jìn)的發(fā)展，使電泳操作實現(xiàn)了自動化。第122頁/共174頁1708年Reuss的實驗1930年Tiselius的裝置最早的電泳裝置-移界(自由)電泳1948年分離血清蛋白的工作獲得諾貝爾化學(xué)獎，成功將血清蛋白分成5個主要成分--清蛋白、α1-、α2-、β-和γ-球蛋白。第123頁/共174頁幾種常用的電泳紙電泳瓊脂電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳O’Farrell的雙向電泳毛細(xì)管電泳第124頁/共174頁紙電泳

(PaperElectrophoresis)

在滲透了緩沖液的濾紙上加上電場，使物質(zhì)移動的電泳法。也就是把樣品以帶狀加在作為支持體的濾紙內(nèi)來檢測其移動和分離的方法。常用以分離性質(zhì)相似的物質(zhì)，如各種氨基酸的分離和稀土元素的分離等。紙電泳可分為低壓電泳和高壓電泳兩類。低壓電泳的電壓一般在100-500V，電流為0-150mA，高壓電泳的電壓一般在500-10000V，50-400mA。第125頁/共174頁紙電泳的儀器裝置包括電泳槽及電泳儀兩大部分。電泳槽是進(jìn)行電泳的裝置，其中包括鉑電極(直徑0.5-0.8cm)、緩沖液槽、電泳介質(zhì)的支架和一個透明的罩。常見的電泳槽有水平式和懸架式等。電泳儀是提供直流電源的裝置，它能控制電壓和電流的輸出。電泳槽內(nèi)的鉑電極經(jīng)隔離導(dǎo)線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連，電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源。第126頁/共174頁瓊脂糖凝膠電泳

（AgaroseGelElectrophoresis）

瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D－半乳糖和3,6脫水L－半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1％－3％，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。第127頁/共174頁水平式電泳第128頁/共174頁第129頁/共174頁聚丙烯酰胺凝膠電泳

(PolyacrylamideGelElectrophoresis,PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(Acrylamide,Acr)和交聯(lián)劑N1,N1-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacrylamide,Bis)在催化劑的作用下聚合而成的含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交鏈起來，鏈縱橫交錯，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。參與反應(yīng)的催化劑有二種成分。一是引發(fā)劑，它提供原始自由基，通過自由基傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)；二是加速劑，它加快引發(fā)劑釋放自由基速度。過硫酸銨和核黃素分別引發(fā)二種不同類型的反應(yīng)。第130頁/共174頁單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺第131頁/共174頁引發(fā)劑加速劑引發(fā)反應(yīng)(NH4)2S2O8(NH4)2S2O8核黃素TEMEDDMAPNTEMED化學(xué)聚合化學(xué)聚合光聚合聚合反應(yīng)催化劑的搭配TEMED:N,N,N1,N1-tetramethylethylenediamineN,N,N1,N1-四甲基乙二胺DMAPN:3-dimethylaminpropionitrile，3-二甲基氨丙腈化學(xué)聚合：過硫酸銨在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，進(jìn)而使單體形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺凝胺的分離膠(小孔膠)，就是通過這種化學(xué)聚合而合成的。光聚合：核黃素在光下形成無色基，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。但過量的氧會阻止鏈長的增加。此法比上法制得凝膠的膠孔大，因此常作電泳中的濃縮膠。第132頁/共174頁凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系

為了使樣品分離得快，操作方便，便于記錄結(jié)果和保存樣本，要求凝膠有一定的物理性質(zhì)，合適的篩孔、一定的機械強度、良好的透明度。這些性質(zhì)很大程度上是由凝膠濃度和交聯(lián)度所決定的。

100ml凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)稱為凝膠濃度，記號為T。

T(%)＝［Acr(g)+Bis(g)］/V(ml)×100%

凝膠溶液中，交聯(lián)劑占單體加交聯(lián)劑總量的百分?jǐn)?shù)為交聯(lián)度，記號為C。

C(%)＝Bis/(Acr+Bis)×100%第133頁/共174頁凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系

凝膠濃度能夠在3-30%中變化，濃度過高時，凝膠硬而脆，容易破碎；濃度太小，凝膠稀軟，不易操作。凝膠濃度主要影響篩孔的大小，篩孔的平均直徑和凝膠濃度的平方根成反比。

T＝5%，網(wǎng)孔的平均直徑為1.5×5A/5%1/2≈33.5AT＝7%，網(wǎng)孔的平均直徑為1.5×5A/7%1/2≈28.3A

交聯(lián)度C反映凝膠結(jié)構(gòu)中甲撐橋的密度。交聯(lián)過高，凝膠是不透明的，并且缺乏彈性；交聯(lián)過低，呈糜糊狀。交聯(lián)度可以決定篩孔的最大直徑。第134頁/共174頁分子量范圍適用的凝膠濃度（%）蛋白質(zhì)：小于1000010000-4000040000-100000100000-50000075000020-3015-2010-155-152-5核酸：小于1000010000-100000100000-2000000015-205-102-2.6分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系第135頁/共174頁聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不反應(yīng)，很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g（1g）(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑。第136頁/共174頁圓盤電泳(DiscElectrophoresis)正面剖面第137頁/共174頁夾心垂直板電泳槽示意圖第138頁/共174頁第139頁/共174頁SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS)蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,簡稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。因此可以利用SDS測定蛋白質(zhì)分子量。第140頁/共174頁第141頁/共174頁樣品和濃縮膠中含Tris-HCl(pH6.8),上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分離膠中含Tris-HCl(pH8.8)。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)。第142頁/共174頁SDS的作用

SDS通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，結(jié)合的數(shù)量與蛋白質(zhì)的分子量成比例，一個SDS分子平均結(jié)合兩個氨基酸殘基，使得蛋白質(zhì)分子帶凈負(fù)電荷，并具有幾乎相同的電荷/質(zhì)量比。SDS結(jié)合引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀近似于雪茄煙形狀的長橢園棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，而長軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變化。這樣的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響。

由于SDS和巰基乙醇的作用，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，解離成亞基或單個肽鏈，因此測定的結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量。第143頁/共174頁連續(xù)系統(tǒng) PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。第144頁/共174頁不連續(xù)系統(tǒng)

不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者為好。第145頁/共174頁不連續(xù)體系

最早由Ornstein(1964)和Davis(1964)設(shè)計，由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。第146頁/共174頁濃縮效應(yīng)的原理

樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界，而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域,它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。第147頁/共174頁（1）樣品濃縮效應(yīng) （a）凝膠孔徑不連續(xù)性 （b）緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性在pH6.7的凝膠緩沖體系中：前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)

尾隨離子(trailingion)或慢離子：甘氨酸根

mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)； （c）電位梯度的不連續(xù)性：（2）分子篩效應(yīng)（3）電荷效應(yīng)第148頁/共174頁不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖第149頁/共174頁A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子；

B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。第150頁/共174頁結(jié)果處理

量出加樣端距溴酚藍(lán)前沿間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR:相對遷移率mR=

蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)第151頁/共174頁測定蛋白質(zhì)的分子量第152頁/共174頁等電聚焦

(Isoelectricfocusing,IFE)

一種特殊的PAGE電泳法，在凝膠柱中加入兩性電解質(zhì)載體-Ampholine，使凝膠柱上產(chǎn)生pH梯度。當(dāng)向兩性載體凝膠施加電場時，即可形成pH梯度，pH梯度的順序是從陽極到陰極pH值逐漸增大。 蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量隨所處環(huán)境的pH而變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在等電聚焦凝膠柱中進(jìn)行電泳時，帶電荷的蛋白質(zhì)離子即在凝膠柱上泳動：帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向陽極移動，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向陰極移動。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品泳動到凝膠的某一部位，這一部位的pH值正好相當(dāng)于該蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的凈電荷為零不再移動，聚焦形成一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。這種按等電點的大小在pH梯度某一相應(yīng)位置進(jìn)行聚焦的方法稱為等電聚焦。第153頁/共174頁第154頁/共174頁第155頁/共174頁（等）電聚焦（IEF）：第156頁/共174頁雙向電泳

(Two-dimensionalElectrophoresis,2-DE)

先后結(jié)合等電聚焦和SDS電泳的技術(shù)被稱為雙向電泳，能使得復(fù)雜蛋白質(zhì)的混合物得到好的分辨。較其他單獨使用的電泳分析方法的靈敏度更高。雙向電泳能分開不同pI但分子量相同或相近的蛋白質(zhì)，也能分開相近pI但不同分子量的蛋白質(zhì)。第157頁/共174頁第一向在圓筒形凝膠進(jìn)行等電聚焦。再將等電聚焦凝膠平放到平板SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，水平方向反映的是pI差距的電泳，垂直方向反映的是分子量差異的電泳。第158頁/共174頁第159頁/共174頁E.coli’sProteins第160頁/共174頁O’Farrell的蛋白質(zhì)雙向電泳銀染結(jié)果考馬斯亮染色為藍(lán)色第161頁/共174頁毛細(xì)管電泳

(CapillaryElectrophoresis,CE)

又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE)，是近年來發(fā)展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行電泳分離，創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動力學(xué)色譜。1987年Hjerten建立了毛細(xì)管等電聚焦,Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝