苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座

苯硫脲嘗味的遺傳學(xué)調(diào)查苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第1頁遺傳學(xué)大試驗(yàn)注意事項(xiàng)1．試驗(yàn)每一步都要詳細(xì)地統(tǒng)計(jì)操作內(nèi)容、時(shí)間、步驟、結(jié)果等，以備查詢。

2．對任何自己不熟悉試驗(yàn)儀器都不要隨意操作（尤其是微量移液器）。在操作過程中發(fā)覺任何意外現(xiàn)象都要及時(shí)向任課教師匯報(bào)。3．在試驗(yàn)過程中制造任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己桌面一角），禁止隨地投棄！尤其注意對廢棄細(xì)菌殺滅和有毒垃圾定點(diǎn)投放。4.試驗(yàn)結(jié)束后要把用過器皿清洗后歸放整齊并清點(diǎn)數(shù)目，向教師匯報(bào)征得同意后方可離開試驗(yàn)室。

苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第2頁1.試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)（1）測定人群中PTC嘗味基因表現(xiàn)型和基因型，了解孟德爾遺傳基因型與表現(xiàn)型對應(yīng)關(guān)系。（2）了解酶切擴(kuò)增多態(tài)序列（cleavedamplifiedpolymorphicsequence，CAPS）（又稱為PCR-RFLP）技術(shù)原理，學(xué)會用CAPS技術(shù)檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。在分子水平上測定PTC嘗味基因型。（3）計(jì)算群體中PTC嘗味基因頻率，判斷群體是否到達(dá)Hardy-weiberg平衡。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第3頁2.試驗(yàn)原理2.1苯硫脲嘗味遺傳形式

苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲苯基衍生物（圖2.1），為白色結(jié)晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能團(tuán)而有苦澀味。能嘗1/750,000~1/50,000PTC濃度溶液味道人（苦澀味，少數(shù)人感到甜味）稱為苯硫脲“嘗味者（taster）”；只能嘗出PTC濃度大于1/24,000溶液味道（甚至對PTC結(jié)晶物也嘗不出苦味）人稱為苯硫脲“味盲者（nontaster）”。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第4頁P(yáng)TC嘗味能力是受單基因控制孟德爾遺傳性狀，是由位于7號染色體上（7q35-7q36）一個(gè)苦味味覺感受器基因TAS2R38決定，屬于常染色體不完全顯性遺傳。嘗味者中顯性基因T純合子(TT)能嘗出1／750,000~1／6,000,000PTC溶液苦味，雜合子(Tt)只能嘗出1／480,000～l／380,000PTC溶液苦味。所以能夠利用對PTC嘗味能力測定家族中基因傳遞和人群中基因頻率。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第5頁2.2人類苯硫脲嘗味基因

人類PTC嘗味基因Homosapienstastereceptor,type2,member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名PTC、T2R38或T2R61。絕大多數(shù)嘗味者與味盲者區(qū)分在于三處單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)：苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第6頁第一處：145位，味盲者為G145（編碼丙氨酸ala），嘗味者為C145（編碼脯氨酸pro）；第二處：785位，味盲者為T785（編碼纈氨酸val），嘗味者為C785（編碼丙氨酸ala）；第三處：886位，味盲者為A886（編碼異亮氨酸ile），嘗味者為G886（碼纈氨酸val）。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第7頁所以味盲者PTC多肽中三處對應(yīng)氨基酸分別是ala49、val262和ile262，被稱為AVI等位基因，而嘗味者三處是pro49、ala262和val262，被稱為PAV等位基因（圖2.2，2.3）。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第8頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第9頁圖2.2味盲者PTC嘗味基因編碼區(qū)（CDS）序列苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第10頁圖2.3味盲者PTC多肽苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第11頁

味盲者PTC編碼區(qū)有五個(gè)限制性內(nèi)切Fnu4H1識別位點(diǎn)（識別序列5’-GC↓NGC-3’），假如是嘗味者，則其第785位SNP恰好形成了一個(gè)額外Fnu4H1識別位（GCTGC）。所以能夠利用這個(gè)SNP造成限制性位點(diǎn)多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含785位SNP位點(diǎn)PTC基因編碼區(qū)一部分，然后用Fnu4H1切割擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)是否能把擴(kuò)增產(chǎn)物切開而判定是某個(gè)人單倍型（haplotype）。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第12頁4.試驗(yàn)步驟（1）講解試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)技術(shù)路線。（2）講解口腔上皮細(xì)胞總DNA快速提取、基因PCR擴(kuò)增、DNA電泳、PCR

產(chǎn)物純化、DNA酶切、遺傳學(xué)分析等試驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)。（3）講解高壓蒸氣滅菌鍋、高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、電泳儀、水平電泳槽、渦旋振蕩器、磁力攪拌器、電子天平、PCR儀、微波爐、紫外分光光度計(jì)、電磁爐、恒溫水浴鍋、恒溫干熱議、凝膠成像儀、制冰機(jī)、超凈工作臺、通風(fēng)櫥、恒溫振蕩搖床、37℃培養(yǎng)箱、pH計(jì)、微量移液器、冰箱、-80℃超低溫冰箱等主要儀器設(shè)備以及必須電腦軟件使用方法、注意事項(xiàng)；苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第13頁4.2.1試驗(yàn)材料

主要儀器設(shè)備高壓蒸氣滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、冰箱。潔凈、經(jīng)121℃高壓滅菌20min容量瓶、量筒、燒杯、螺口試劑瓶，一次性醫(yī)用無菌PE手套、乳膠手套、塑料滴管，一次性紙杯，記號筆。4.2PTC嘗味能力測定苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第14頁

試劑和材料

（1）材料：受試者為全體修讀遺傳學(xué)大試驗(yàn)學(xué)生。

（2）試劑：苯硫脲（PTC）結(jié)晶，娃哈哈純凈水。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第15頁

溶液配制（1）原液（1號液）：稱取PTC結(jié)晶0.65g，加娃哈哈純凈水500ml，在室溫(20℃左右)下溶解l~2d（經(jīng)常搖擺）（或60℃水浴中1h充分溶解），PTC濃度約為1／750，過濾滅菌。

（2）稀釋液：用娃哈哈純凈水逐層稀釋原液2~14倍，編為2-14號（表4.1）。將配好14種濃度PTC溶液，過濾滅菌，分別置于滅菌過100ml螺口試劑瓶中。另取娃哈哈純凈水作為第15號液。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第16頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第17頁4.2.2試驗(yàn)方法（1）讓受試者正坐，仰頭張嘴伸舌，用滴管滴2～3滴15號液于受試者舌根部，讓受試者慢慢咽下重復(fù)咂嘴品味液體嘗味，然后用純凈水做一樣試驗(yàn)，交替給受試者嘗味，防止受試者臆意猜測而影響結(jié)果準(zhǔn)確。（2）問詢受試者能否判別此兩種溶液味道。（3）若不能判別或判別不準(zhǔn)，則依次用14~1號溶液重復(fù)試驗(yàn)，直到能明確判別出PTC苦味為止。（4）復(fù)嘗味3次，3次結(jié)果相同時(shí)，才是可靠。（5）統(tǒng)計(jì)所品出苦味液體編號和稀釋濃度。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第18頁注：統(tǒng)計(jì)民族、生源地是想調(diào)查PTC味盲分布與民族和地理位置是否有相關(guān)性。（此生源地統(tǒng)計(jì)不是受試者戶籍所在地，而是其家族或家庭組員長久生活地方）苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第19頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第20頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第21頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第22頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第23頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第24頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第25頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第26頁苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第27頁4.3人口腔上皮細(xì)胞總DNA提取4.3.1試驗(yàn)材料

主要儀器設(shè)備高壓蒸氣滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、渦旋振蕩器、高速離心機(jī)、恒溫振蕩搖床、微量移液器、電磁爐、冰箱、-80℃超低溫冰箱、計(jì)時(shí)器、pH計(jì)。潔凈、經(jīng)121℃高壓滅菌20min量筒、燒杯、螺口試劑瓶、牙簽、1.5mL滅菌微量離心管、微量移液器吸頭（槍頭），離心管架，一次性醫(yī)用無菌PE手套、乳膠手套、口罩，記號筆。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第28頁4.3人口腔上皮細(xì)胞總DNA提取試劑和材料（1）材料：每試驗(yàn)小組選取1名受試者，用滅菌牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞。（2）試劑：滅菌水，pH標(biāo)準(zhǔn)液，細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第29頁4.3人口腔上皮細(xì)胞總DNA提取4.3.2試驗(yàn)方法（1）在1.5ml滅菌微量離心管中加入100μL滅菌水。（2）受試者用無菌牙簽輕刮口腔腮內(nèi)側(cè)，刮下來細(xì)胞在滅菌水中漂洗。（3）渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻10s，（4）離心機(jī)瞬時(shí)離心10s。（5）沸水浴中煮沸5min。（6）離心機(jī)13200rpm離心2min。（7）基因組DNA4?C保留備苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第30頁4.5PTC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

4.5.1.主要儀器設(shè)備高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、電泳儀、水平電泳槽、電子天平、微波爐、凝膠成像儀、制冰機(jī)、超凈工作臺、通風(fēng)櫥、微量移液器、冰箱、-80℃超低溫冰箱。潔凈、經(jīng)121℃高壓滅菌20min、微量移液器吸頭（槍頭），離心管架，PCR管架，三角瓶，一次性醫(yī)用無菌PE手套，記號筆，保鮮袋，微波爐用手套，三角瓶，搪瓷盤。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第31頁4.5.2.試劑和材料（1）材料：受試者PTC基因PCR產(chǎn)物（2）試劑：Tris堿，冰乙酸，Na2EDTA.2H2O,溴化乙錠，瓊脂糖，MarkerI4.5.3.溶液配制（1）50×TAE電泳緩沖液（儲存液，pH約8.5）：Tris堿242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，去離子水定容至1L（2）1×TAE電泳緩沖液（工作液）：取50×TAE電泳緩沖液，去離子水稀釋50倍

苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第32頁

(3）0.5mg/ml溴化乙錠（EB）（1000儲存液）：50mg溴化乙錠溶于100mLdd

water，4C避光儲存）。

(4)溴化乙錠（EB）工作液：0.5mg/mlEB（1000儲存液），去離子水稀釋1000倍。（注：EB為扁平分子，能夠嵌入DNA，為潛在誘變劑，接觸時(shí)須帶一次性醫(yī)用無菌PE手套，但也不是洪水猛獸，不小心濺到皮膚上時(shí)，不會被皮膚吸收只是停留在表面，用大量流水沖洗即可）。

苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第33頁

（1）配制1.2%瓊脂糖凝膠：稱取0.6g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml1×TAE電泳緩沖液，放入微波爐中加熱，并不停取出混勻，注意觀察燒瓶中瓊脂糖粉末，直至完全熔解（燙，戴手套）。50ml恰好倒一塊大膠（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中?。?/p>

（2）將膠液置桌面上室溫冷卻致熱但不燙手（約50-60℃）。

4.5.2試驗(yàn)方法苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第34頁（3）把梳子插到凝膠灌制模具正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具矮邊緣相平即可。在桌面上靜置10-20分鐘待膠完全凝固.（剩下膠溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝膠沒入電泳槽電泳液中，凝膠上有樣品孔一側(cè)要朝向電泳槽負(fù)極。

苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第35頁（4）取1片光面紙，點(diǎn)5uL滅菌水、2uL6×加樣緩沖液，再加入5uLPCR產(chǎn)物制成10uLDNA樣品。（5）在凝膠上選擇相鄰加樣孔。用10ul吸液頭分別依次加入5uLMarkerI對照，各小組12uLPCR產(chǎn)物電泳樣品（相互比較）（6）依據(jù)電泳槽長度把電泳儀電壓調(diào)至120V(10V/cm)，電泳20~30min。（注意正負(fù)電極位置連接正確）。（7）把凝膠小心放入盛有EB搪瓷盤中，染色10分鐘后，取出用自來水浸泡10min。（8）放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第36頁4.6.1試驗(yàn)材料

主要儀器設(shè)備高壓蒸氣滅菌鍋、高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、渦旋振蕩器、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、恒溫干熱議、制冰機(jī)、紫外分光光度計(jì)、微量移液器、冰箱、-80℃超低溫冰箱。潔凈、經(jīng)121℃高壓滅菌20min1.5mL滅菌微量離心管、微量移液器吸頭（槍頭），離心管架，一次性醫(yī)用無菌PE手套，塑料飯盒，記號筆。4.6PTC基因PCR產(chǎn)物酶切苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第37頁

試劑和材料（1）材料：受試者PTC基因PCR產(chǎn)物（2）試劑：限制性內(nèi)切酶Fnu4H1苯硫脲嘗味遺傳大實(shí)驗(yàn)專家講座第38頁4.6.2試驗(yàn)方法（1）提前2h