體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價

生物樣本經(jīng)預(yù)處理后，選取適當(dāng)方法進(jìn)行測定?？晒┥矬w液中藥品及其代謝物含量測定分析方法很多，歸納起來主要有三類：（一）光譜分析法（二）免疫分析法（三）色譜分析法體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第1頁除以上三類主要方法外，在生物藥品分析中有時還使用同位素標(biāo)識藥品，它們主要應(yīng)用于RIA、同位素逆稀釋分析，或作為GC-MS分析內(nèi)標(biāo)，以及在藥品分離中作示蹤應(yīng)用等。另外，還有一些含抗生素類藥品生物樣品，它們可用微生物方法測定，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散作用，比較樣品與藥品標(biāo)準(zhǔn)品二者對接種試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈大小，借以測定樣品內(nèi)抗生素藥品濃度。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第2頁（一）光譜分析法光譜分析法包含比色測定、紫外分光光度法和熒光分光光度法。光譜法在體內(nèi)藥品分析中是應(yīng)用較早方法之一，依據(jù)陸明廉對我國1975～1984年間血藥濃度測定方法統(tǒng)計，應(yīng)用光譜法占應(yīng)用血藥分析方法總數(shù)三分之一。即使近十多年來色譜法飛速發(fā)展，使光譜法退出了體內(nèi)藥品分析應(yīng)用方法主角地位，但因其操作簡便、快速，在體內(nèi)藥品分析中仍占有一定地位。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第3頁因?yàn)楣庾V法不具備分離功效，選擇性較差，所以對樣品預(yù)處理要求較高。選取專屬方法或試劑與之反應(yīng)，測定衍生物熒光或?qū)馕諒?qiáng)度，也可借助數(shù)學(xué)方法消除干擾。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第4頁1、比色法比色法靈敏度不高，通常只能測定出1ug/ml濃度以上樣品。但該法含有快速，簡便，對儀器要求不高等特點(diǎn)。只要采取含有選擇性顯色劑和反應(yīng)條件，可不經(jīng)分離提取等步驟，直接用于血藥濃度監(jiān)測。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第5頁2、紫外分光光度法分光光度法靈敏度較比色法高，適合用于測定含有紫外吸收藥品，方法簡單，儀器要求也不高。但用于測定含藥濃度低樣品時，也受到一定限制。如測定體液中藥品濃度時，亦可能受體液中內(nèi)源性雜質(zhì)干擾和影響。所以，本法在體內(nèi)藥品分析中也受到靈敏度和專一性限制。但采取一些光譜分析技術(shù)，如用差示分光光度法，導(dǎo)數(shù)分光光度法，雙波長和三波長分光光度法等，可適當(dāng)提升方法靈敏度和選擇性，也可消除雜質(zhì)干擾，所以，該法當(dāng)前仍用于一些生物樣品中藥品檢測。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第6頁3、熒光分光光度法熒光分光光度法靈敏度比紫外-可見分光光度法靈敏度高，最高可到達(dá)10-12g/mL，即使有熒光物質(zhì)數(shù)量不多，但體內(nèi)許多主要生化物質(zhì)、藥品及其代謝物或致癌物都有熒光現(xiàn)象。因?yàn)闊晒庋苌镌噭┦褂?，深入擴(kuò)大了熒光分光光度法應(yīng)用，所以該法在體內(nèi)藥品分析和藥品動力學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第7頁（二）免疫分析法免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、熒光免疫分析等。該法原理是利用抗原-抗體特異反應(yīng)來測定體內(nèi)藥品含量。該法含有靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，是臨床治療藥濃監(jiān)測和生化檢驗(yàn)慣用方法，但需要一定試劑盒和儀器。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第8頁

(三)色譜分析法色譜方法包含HPLC、GC和TLC等方法。色譜法在我國體內(nèi)藥品分析中應(yīng)用始于20世紀(jì)80年代，因?yàn)樯V法含有分離分析功效，含有高專屬性和靈敏度，并能同時分離分析結(jié)構(gòu)相同藥品和代謝物等優(yōu)點(diǎn)，使得其近20年來發(fā)展快速，尤其是HPLC法，己在體內(nèi)藥品分析領(lǐng)域中確立了主導(dǎo)地位，慣用作體內(nèi)藥品分析中評價其它方法參比喻法。近年手性色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、色譜與光譜聯(lián)用技術(shù)、色譜與免疫聯(lián)用技術(shù)等建立與發(fā)展，更為色譜技術(shù)在體內(nèi)藥品分析中應(yīng)用增添了無量前景。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第9頁1、HPLC法HPLC法在體內(nèi)藥品分析中應(yīng)用已大大超出其它分析方法，成為體內(nèi)藥品分析中應(yīng)用最廣泛技術(shù)之一。與GC法相比，它含有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)適用范圍廣，可在室溫下進(jìn)行檢測。對于揮發(fā)性低，熱穩(wěn)定性差，分子量大以及離子型化合物等均可測定。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第10頁(2)樣品預(yù)處理簡單，可不經(jīng)萃取和衍生化處理直接測定極性大水溶性藥品，尤其適合生物樣品測定；(3)分離效率高，流動相選擇范圍廣，儀器自動化程度高。(4)檢測器多是針對整分子光譜特征進(jìn)行檢測，專一性較高。檢測方法多采取非破壞性。流出組分可回收，可用于樣品制備。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第11頁2、GC法GC法是最先興起含有分離和分析兩種功效測定技術(shù)，在藥品分析和體內(nèi)藥品分析中曾得到較廣泛應(yīng)用。因?yàn)镠PLC法發(fā)展，尤其是RP-HPLC(反相-高效液相色譜法）廣泛應(yīng)用，使GC法應(yīng)用相對降低。其原因是GC法本身含有一些缺點(diǎn)，應(yīng)用時常受被測組分揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性等方面限制。用GC測定藥品時普通需要在120℃以上柱溫條件下進(jìn)行，所以不適適用于遇熱不穩(wěn)定和極性大或揮發(fā)性差藥品，不適適用于生物樣品測定。因而影響該法在體內(nèi)藥品分析中廣泛應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第12頁（四）毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法(CE)，又稱高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)，是20世紀(jì)末發(fā)展起來一個高效、快速分析技術(shù)。HPCE是以高電壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品各組分之間淌度和分配系數(shù)不一樣而實(shí)現(xiàn)分離一類液相分離技術(shù)。近年來HPCE發(fā)展十分快速，已在化學(xué)、生命科學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第13頁因?yàn)樵摲ê懈咝?、快速、靈敏、進(jìn)樣少、信息量大、運(yùn)行成本低、易于自動化等優(yōu)點(diǎn)。所以使其在體內(nèi)藥品分析及其代謝檢測中得到廣泛應(yīng)用。依據(jù)HPCE法分離模式不一樣。HPCE又分為：毛細(xì)管區(qū)帶電泳、膠束電動毛細(xì)管色譜、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管等速電泳和毛細(xì)管電色譜法。上述這些方法近幾年來在體內(nèi)藥品分析中均得到不一樣程度應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第14頁體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第15頁選取何種方法進(jìn)行體內(nèi)藥品分析為好呢？普通要依據(jù)藥品理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)持征、藥品濃度大小、干擾成份多少、預(yù)處理方法、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)以及試驗(yàn)室條件等原因綜合起來進(jìn)行考慮。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第16頁分析方法設(shè)定依據(jù)

(一)做好文件總結(jié)、整理工作對已經(jīng)有報道藥品進(jìn)行測定，應(yīng)系統(tǒng)總結(jié)前人文件，從中找出哪些問題已處理，還存在哪些問題等。對尚無文件報道，也可依據(jù)藥品性質(zhì)情況，參考相同類型藥品文件資料。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第17頁(二)充分了解待測藥品特征與體內(nèi)情況藥品理化性質(zhì)和體內(nèi)過程是建立方法主要依據(jù)。藥品理化性質(zhì)包含酸堿性(pKa)、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、穩(wěn)定性等，這些性質(zhì)與分析方法選擇、試驗(yàn)條件改進(jìn)親密相關(guān)。與常規(guī)分析方法不一樣，體內(nèi)藥品分析對象是來自生物體內(nèi)樣品，所以對藥品在體內(nèi)情況必須了解，如藥動學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況等。這包括樣品取樣頻率與間隔，分析方法選擇等。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第18頁(三)明確測定目標(biāo)、要求應(yīng)了解擬建立方法是用于測定藥代動力學(xué)參數(shù)，還是用于臨床藥濃監(jiān)測。前者要求含有一定靈敏度和準(zhǔn)確度，不強(qiáng)調(diào)簡便、快速，設(shè)計方法時應(yīng)考慮到不一樣時間取得樣品中藥品濃度改變較大這一原因。而用于臨床藥濃監(jiān)測，則要求方法簡便、快速。另外，是否要求同時測定母體藥品和代謝物，若需同時測定二者，則應(yīng)選擇含有分離能力或?qū)贉y定方法。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第19頁（四）結(jié)合試驗(yàn)室條件依據(jù)試驗(yàn)室現(xiàn)有和可能取得設(shè)備條件加以考慮，選擇可行方法。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第20頁方法建立普通試驗(yàn)步驟

方法初步確定后，還需進(jìn)行一系列試驗(yàn)工作，以選擇最正確試驗(yàn)條件及驗(yàn)證所確定方法是否適合實(shí)樣檢測。通常包含以下步驟：（一）以純品進(jìn)行測定取藥品或其代謝物純品適量，按確定方法測定，求得濃度與測定響應(yīng)值之間關(guān)系，進(jìn)行線性范圍、最適測定濃度、檢測靈敏度、測定最適條件(如pH值、溫度、反應(yīng)時間等）等選擇。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第21頁(二)空白樣品測定取空白生物樣品，按確定方法進(jìn)行處理，測定空白值(或色譜圖)?？瞻字蹈叩突蛏V圖情況將影響到方法靈敏度和專屬性，應(yīng)力爭將空白值降低。在色譜分析中應(yīng)力爭降低體內(nèi)樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)峰，對無法消除內(nèi)源性雜質(zhì)峰應(yīng)設(shè)法使其從待測物色譜區(qū)域內(nèi)移開。能否取得良好樣品空白試驗(yàn)結(jié)果，是決定測定方法實(shí)際可行性主要步驟，必須設(shè)法處理。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第22頁(三)以水代替空白樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后測定以水代替空白生物樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后按確定方法進(jìn)行測定，以了解提取回收率及最低檢測濃度大致情況，從而對萃取溶劑、pH值、揮發(fā)濃縮等條件進(jìn)行選擇。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第23頁(四)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)后測定于空白生物樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品后按確定方法進(jìn)行測定，求得樣品回收率數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若采取色譜法測定，多數(shù)情況下需要用內(nèi)標(biāo)法定量，則應(yīng)首先選擇適當(dāng)內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行回收率測定。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第24頁(五)體內(nèi)實(shí)際樣品測定經(jīng)過上述(一)至(四)步驟后進(jìn)行實(shí)際樣品測定。但要指出是，以上步驟只是生物樣品實(shí)樣檢測前準(zhǔn)備工作，不能完全確定是否適合用于實(shí)樣測定。因藥品在體內(nèi)改變是復(fù)雜，如不注意藥品代謝和蛋白結(jié)合情況，則應(yīng)用體外建立方法，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)樣測定時往往會失敗，甚至造成錯誤結(jié)論，所以在設(shè)計方法時強(qiáng)調(diào)對藥品體內(nèi)過程要有一定程度了解，從而選擇防止干擾和適合樣品實(shí)際情況方法。有時也可采取專屬性強(qiáng)，已證實(shí)用于體內(nèi)實(shí)樣測定步驟和方法作為對照測定，以此來檢驗(yàn)所建立方法實(shí)際可行性。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第25頁方法評價

對于所建立體內(nèi)藥品分析方法可行性與可靠性，需要應(yīng)用若干標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行方法學(xué)考查與評價。這是研究和建立一個新分析方法時必須著重抓住幾個步驟。評價一個體內(nèi)藥品分析方法優(yōu)劣主要有以下幾個指標(biāo)：精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、專屬性或選擇性、可測濃度范圍、測定所需時間以及對生物樣品適應(yīng)性等，現(xiàn)擇要討論以下：體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第26頁（一）準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(accuracy)是方法評價最基本關(guān)鍵點(diǎn)之一，它是表示測定結(jié)果與真值符合程度。慣用回收率(recovery)數(shù)值反應(yīng)測定準(zhǔn)確程度，也可經(jīng)過與其它已建立方法進(jìn)行比較方法來加以反應(yīng)。將已知量藥品純品加到空白樣品(如血樣)中去，經(jīng)過一系列處理、測定，所得藥品量與加入量之比值百分率即為回收率。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第27頁回收率當(dāng)然越靠近100％越好，但因樣品組分復(fù)雜，含量低，處理步驟多時就極難到達(dá)高回收率。對于一個方法來說，更為主要是每次測定所得回收率要保持恒定，即使有時回收率較低，但只要重現(xiàn)性好，經(jīng)過校正后仍可采取。依據(jù)回收率測定方法不一樣可分為絕對回收率和方法回收率。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第28頁1．絕對回收率絕對回收率也稱萃取回收率、提取回收率，它反應(yīng)了一個方法萃取效率，與體內(nèi)樣品檢測靈敏度相關(guān)，是評價體內(nèi)藥品分析方法主要指標(biāo)之一?，F(xiàn)以色譜法為例，說明絕對回收率求算過程。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第29頁比如取一定量被測藥品標(biāo)準(zhǔn)品，加到空白血樣中，按要求方法處理，使最終溶液中藥品標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1ug/mL，測定色譜峰面積，記為A測，另取1ug/mL藥品標(biāo)準(zhǔn)品純?nèi)軇┤芤阂私舆M(jìn)樣，測得色譜峰面積記為A真，用外標(biāo)法計算。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第30頁絕對回收率應(yīng)考查高、中、低3個濃度，低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上限附近，中間選一個濃度。對于回收率大小與變異不宜苛求，普通添加量在10-6～10-9級，絕對回收率若能到達(dá)50％～80％，應(yīng)認(rèn)為是令人滿意。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第31頁在色譜分析中常采取內(nèi)標(biāo)法測定含量，將藥品標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加到空白血樣中，按要求方法處理，測得藥品和內(nèi)標(biāo)峰面積，求出它們比值R測＝A藥/A內(nèi)。另取相同濃度藥品標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純?nèi)軇┤芤哼M(jìn)樣，得藥品標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)峰面積，計算二者比值R真＝A'藥/A'內(nèi)。再依據(jù)下式求出回收率：體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第32頁在內(nèi)標(biāo)法中，應(yīng)注意藥品與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各自用外標(biāo)法測得絕對回收率應(yīng)相近，二者相差應(yīng)小于10％，不然回收率偏離100％太遠(yuǎn)。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第33頁

2．方法回收率取一系列濃度藥品標(biāo)準(zhǔn)品加到空白體液中，按設(shè)定方法測定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及響應(yīng)測定信號值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，先按最小二乘法求出回歸方程。然后取高、中、低濃度藥品標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白體液中，每個濃度最少平行測定5份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法同法測定，所得信號值代入回歸方程，求得測定值。最終與加入量比較，得方法回收率。除定量限外，各濃度點(diǎn)測得平均值偏離實(shí)際加入量應(yīng)小于15％，定量限這一點(diǎn)應(yīng)小于20％。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第34頁在測定回收率時，不論采取何種方法，都要注意以下幾個問題：①添加藥品量必須與實(shí)際測定量相近；②添加物質(zhì)必須與實(shí)際存在狀態(tài)相同；③必須同時做空白試驗(yàn)。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第35頁上述①、②兩點(diǎn)原因：一是假如添加量大，實(shí)際測定量小，那么有可能測定量在回收率誤差范圍內(nèi)，這么就不可靠；二是假如添加量大，蛋白質(zhì)實(shí)際結(jié)合能力小，這么存在在空白血樣中添加藥品部分沒有結(jié)合，與實(shí)際存在情況不符，測得回收率輕易偏高。所以在報道一個方法回收率時，必須說明添加量。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第36頁方法準(zhǔn)確度有時也可用一個已證實(shí)有相當(dāng)專屬性和可靠性方法與新建立方法同時進(jìn)行測定，然后比較兩法測得結(jié)果相關(guān)程度。用相關(guān)系數(shù)r來表示，普通要求r＞0.95，直線斜率靠近1，表明兩法吻合。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第37頁(二)精密度精密度(precision)是表示一組測量值彼此符合程度。有各種表示方法，在體內(nèi)藥品分析中慣用表示方法有：體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第38頁精密度測定通常采取高、中、低三種濃度進(jìn)行測定。低濃度選擇在定量限(LOQ)附近，高濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上限附近，中間選一個濃度。每個濃度平行測定5～7次，計算測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差。除定量限外，各濃度點(diǎn)RSD不應(yīng)大于15％，最低定量限這一點(diǎn)不應(yīng)大于20％。精密度可深入分為日內(nèi)或批內(nèi)精密度和日間或批間精密度。前者表示一次測定重復(fù)性，后者表示不一樣時間測定結(jié)果重復(fù)性。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第39頁日內(nèi)(或批內(nèi))精密度是考查分析方法在短期內(nèi)測定方法變異情況，凡是在同一天內(nèi)將樣品屢次測定所計算出精密度稱為日內(nèi)精密度；凡在同一批內(nèi)樣品屢次測定所計算出精密度稱為批內(nèi)精密度。所謂“批內(nèi)”是指測定時使用同批試劑、同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線等主要相同條件下完成分析測定。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第40頁日間(或批間)精密度是考查分析方法在不一樣時間測定結(jié)果變異情況。因?yàn)轶w內(nèi)藥品分析面臨樣品數(shù)量多，測定連續(xù)時間長，往往在同一天或同一批內(nèi)不能完成，所以樣品測定時使用儀器性能、試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生微小改變，從而造成分析結(jié)果變異增大。所以，考查分析方法精密度時，還應(yīng)考查日間或批間精密度。測定時可使用日內(nèi)(或批內(nèi))精密度測定時，所使用高、中、低三種濃度樣品，在同一周內(nèi)不一樣日(或不一樣批)分別測定3～5次，然后計算出RSD。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第41頁（三）靈敏度靈敏度(sensitivity)是指一個方法能夠檢測出相關(guān)化合物最小量，慣用以下幾個表示方法。1．檢測限(limitofdetection，LOD)檢測限表示在生物介質(zhì)中藥品最低可測度(或絕對量)。通常以被測信號和背景噪音比S/N為2～3倍時被測物絕對量來表示，LOD＝3N/S（N＝噪音，S＝被測物信號/單位重量)。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第42頁比如，在色譜分析中，測得N＝1mm，取2ug/mL樣品液20uL進(jìn)樣，測得峰高為30mm。按上式計算：即以S/N＝3時，測得樣品LOD為4ng。也可經(jīng)過屢次空白試驗(yàn)，求得背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差，再乘以2或3，作為LOD預(yù)計值，然后配制對應(yīng)檢測限濃度樣品，重復(fù)測試來確定。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第43頁2．定量限(limitofqnantification，LOQ)定量限是指生物介質(zhì)中藥品可定量測定最低量，表示方式和測定方法與檢測限相同，它與檢測限不一樣在于定量限要求最低測得濃度應(yīng)該符合一定精密度和準(zhǔn)確度要求。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第44頁通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)作為定量限。也能夠S/N＝10或空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差乘以10作為預(yù)計值，再經(jīng)過試驗(yàn)確定。在進(jìn)行藥品制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)時要求LOQ最少能滿足測定3～5個半衰期時樣品中藥品濃度，或Cmax1/10～1/20時藥品濃度。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第45頁3．最低檢測濃度最低檢測濃度則多指可進(jìn)行定量測定某一藥品最低濃度，它與樣品體積大小等原因相關(guān)，可經(jīng)過下式求得，體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第46頁以上表示靈敏度方法均是指儀器靈敏度，即進(jìn)入儀器最低絕對量或最低濃度。假如我們要知道體內(nèi)樣品濃度檢測限，則要依據(jù)樣品處理方法，考慮稀釋度。體內(nèi)樣品濃度檢測限＝儀器濃度檢測限×樣品稀釋度體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第47頁比如，取血樣1mL，經(jīng)處理后進(jìn)樣前血樣最終體積為0.1mL，已知最低檢測濃度為10-6，則血樣中被測物最低濃度為0.1×10-6。若經(jīng)處理后，最終體積為10mL，則血樣中被測物最低濃度為10×10-6。這表明即使儀器靈敏皮相同，但因樣品預(yù)處理方法不一樣，就有可能影響到實(shí)際樣品測定靈敏度。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第48頁要提升檢測靈敏度，可采取以下一些方法：①提升儀器本身靈敏度；②提升進(jìn)樣量；③降低儀器噪音；④提升樣品濃縮程度或降低樣品稀釋度；⑤消除干擾，降低空白值，這可經(jīng)過改變色譜條件，改進(jìn)預(yù)處理方法來降低于擾雜質(zhì)影響。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第49頁（四）方法專屬性方法專屬性(specificity)也稱選擇性(selectivity)，是指樣品中含有其它共存物質(zhì)時，該法定量測定被測物能力。即測定訊號應(yīng)是屬于被測物所特有，不然就易受干擾?？疾橐粋€方法是否專屬，應(yīng)著重考慮代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)和同時服用藥品干擾。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第50頁專屬性測定通常取6個個體空白樣品(要求對這6個個體取樣時間、膳食結(jié)構(gòu)以及影響試驗(yàn)其它原因加以控制)，采取確定方法進(jìn)行測定。所得結(jié)果與靠近于定量限被測物濃度純?nèi)軇┤芤核媒Y(jié)果進(jìn)行比較。在藥品、代謝物、內(nèi)標(biāo)物tR處不應(yīng)有大干擾，任何有大干擾空白應(yīng)舍去。假如大于10％空白樣品顯示大干擾，應(yīng)另取一組空白樣品重試，假如仍有10％以上空白樣品顯示大干擾，則應(yīng)改變確定方法，以消除干擾。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第51頁在匯報專屬性時，若采取色譜法測定，最少要提供空白生物樣品色譜圖，空白生物樣品外加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及用藥后樣品色譜圖。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第52頁(五)線性范圍線性范圍(1inearrange)是指利用該法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求試驗(yàn)結(jié)果，而且成線性供試物濃度改變范圍。通常是將藥品標(biāo)準(zhǔn)品加入空白體液中，制成一系列不一樣濃度標(biāo)準(zhǔn)液，按要求方法處理、測定。依據(jù)藥品標(biāo)準(zhǔn)品濃度和響應(yīng)信號值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或計算回歸方程，求出r值和濃度范圍。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第53頁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備普通由一個空白，一個零標(biāo)準(zhǔn)(空白樣品加內(nèi)標(biāo))和5～8個非零標(biāo)準(zhǔn)(系列濃度標(biāo)樣)組成，要求覆蓋實(shí)際樣品濃度范圍，包含LOQ。空白和零標(biāo)準(zhǔn)不用作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，僅作為對干擾考查。線性程度可用最小二乘法處理數(shù)據(jù)，求得相關(guān)系數(shù)r，普通r不應(yīng)低于0.99，同時必須符合一定精密度和準(zhǔn)確度。要求LOQ處偏離標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)小等于20％，其它各點(diǎn)應(yīng)小等于15％。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第54頁（六）穩(wěn)定性藥品穩(wěn)定性(stability)是貯存條件、藥品化學(xué)性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)函數(shù)。在特定容器和生物樣品中待測物穩(wěn)定性不能外推至其它系統(tǒng)。在生物樣品中待測物穩(wěn)定性包含長久貯存、短期貯存和冷凍-解凍循環(huán)過程中穩(wěn)定性，也包含標(biāo)準(zhǔn)貯備液中待測物穩(wěn)定性。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第55頁1．長久貯存穩(wěn)定性長久穩(wěn)定性貯存時間應(yīng)超出搜集第一個樣品至最終一個樣品分析所需時間周期。貯存溫度一船為-20℃，假如需要也可在-70℃貯存。要求高、低濃度最少分別測定3次，與第一天測得對應(yīng)濃度結(jié)果進(jìn)行比較。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第56頁2．短期室溫穩(wěn)定性高、低濃度各3份于室溫下放置4～24h(依據(jù)實(shí)際操作在室溫中需維持時間而定)，在不一樣時間點(diǎn)取樣，進(jìn)行分析，與0h測得結(jié)果進(jìn)行比較。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第57頁3．冷凍-解凍穩(wěn)定性取高、低濃度樣品最少各3份，于-20℃貯存24h，取出置室溫放置使自然融解。當(dāng)融解完全后，取樣，進(jìn)行分析。然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持12～24h，如此解凍-冷凍應(yīng)重復(fù)循環(huán)二次以上，然后比較各次分析結(jié)果。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第58頁4．貯備液穩(wěn)定性藥品與內(nèi)標(biāo)貯備溶液穩(wěn)定性應(yīng)對其在室溫下最少6h穩(wěn)定性進(jìn)行考查，然后將其冷藏或冷凍7～14d或恰當(dāng)周期后進(jìn)行測定，所得儀器響應(yīng)值與新鮮配制溶液所得響應(yīng)值進(jìn)行比較。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第59頁應(yīng)用實(shí)例

例1：用HPLC法測定生物樣品中淫羊藿苷濃度。1、試驗(yàn)方法(1)色譜條件色譜柱：ZorbaxODS(10um，4.6mm×250mm)；柱溫：35℃；流動相：四氫呋喃-水-冰醋酸(20：75：5)；流速：1.0mL/min；紫外檢測波長：270nm；檢測靈敏度：0.02UFS。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第60頁(2)生物樣品處理①血漿：取樣品0.1mL置10mL離心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振蕩3min，離心(r/min，5min)，移取上清液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈?，殘渣加?nèi)標(biāo)液100uL，振蕩溶解后進(jìn)樣20uL。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第61頁②糞和尿：大鼠糞便樣品于室溫風(fēng)干稱重后，置乳缽內(nèi)研成細(xì)末，用生理鹽水按10％稀釋使其成混懸液。取混懸液0.5mL或尿樣0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取兩次，合并兩次提取液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈?，加入甲?.0mL，振蕩溶解后進(jìn)樣10uL。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第62頁③組織勻漿：將大鼠斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腦、睪丸各組織，稱重，用組織勻漿器制成生理鹽水勻漿，使每mL含各組織0.4g，取此勻漿0.2mL，按血漿樣品處理方法進(jìn)行處理分析。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第63頁2．結(jié)果與討論(1)色譜行為在上述色譜條件下，淫羊藿苷(icariin，ICA)與內(nèi)標(biāo)、淫羊藿提取液中其它6種成份及血漿內(nèi)源性物質(zhì)得到良好分離(見圖4-1)，ICA及內(nèi)標(biāo)苯甲酸保留時間分別為7.92min和11.93min。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第64頁體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第65頁(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備用甲醇精密配制成1mg/mLICA標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再用甲醇稀釋成100ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保留。另用甲醇制成1mg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液，再用甲醇稀釋成40ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保留。用ICA標(biāo)準(zhǔn)工作液及空白生物樣品配制標(biāo)準(zhǔn)系列，按樣品預(yù)處理方法操作，以ICA與IS峰高比為縱坐標(biāo)，ICA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第66頁因?yàn)榧S和尿中代謝產(chǎn)物干擾內(nèi)標(biāo)色譜峰，所以糞和尿采取外標(biāo)法、以ICA峰高為縱坐標(biāo)，ICA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果血漿、尿、組織勻漿和糞線性范圍分別為：1～128，2～32，2～32，4～64ug/mL。血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(n＝6)為：其它生物樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程r值均大于0.99。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第67頁(3)回收率分別于空白血漿中準(zhǔn)確加入一定量ICA標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述方法經(jīng)提取后進(jìn)行HPLC分析，按血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測得濃度，求出方法回收率。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)提取后，與標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣測定所得各對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰高比值相比較，求得血漿樣品提取回收率，見表4-1。其它生物樣品方法回收率均大于95.26％，提取回收率均大于73.57％。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第68頁體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第69頁(4)精密度用空白血漿制成含ICA2，8，32，128ug/mL樣品溶液各5管，測定日內(nèi)及日間誤差，結(jié)果見表4-1。其它生物樣品日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于7.1％。(5)靈敏度測定按色譜峰信噪比(S/N)為3作為檢測下限，結(jié)果顯示ICA最低檢測濃度為0.5ug/mL。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第70頁(6)色譜分析條件選擇淫羊藿提取液中主要化學(xué)成份為淫羊藿苷，還有其它黃酮類化合物存在，所以在上述色譜條件下可出現(xiàn)6～7個蜂。為了取得最正確分離效果，首先用甲醇:水為流動相進(jìn)行分離，當(dāng)百分比為55:45時，即使ICA與其它化學(xué)成份已分離，但其保留時間較長，峰形較寬，且柱壓較高。為此，選取對黃酮類化合物分離選擇性很好四氫呋喃，并加入一定量冰醋酸，使弱酸化合物分離效果更佳。經(jīng)過調(diào)整不一樣百分比，屢次試驗(yàn)，最終確定四氫呋喃:水:冰醋酸最正確配比為20:75:5。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第71頁(7)內(nèi)標(biāo)選擇為能用內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確測定ICA濃度，本文對槲皮素、蘆丁、橙皮苷、氨茶堿、阿斯匹林、非那西汀、黃體酮、苯甲酸和蘭萼甲素等13種藥品進(jìn)行了測定，考查其與ICA在血漿中分離情況，結(jié)果用保留時間小于ICA藥品作內(nèi)標(biāo)時，往往被血漿中干擾峰所干擾。阿斯匹林、非那西汀均在ICA前1～5min出峰，卻被淫羊藿提取液中其它成份所干擾。蘭萼甲素和苯甲酸均在ICA后2～4min出峰，沒有任何峰干擾，所以二者均可作為內(nèi)標(biāo)，考慮到苯甲酸方便易得，故選取苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第72頁(8)提取溶媒選擇本文考查了用乙醇、乙酸乙酯及乙醇:乙酸乙酯(1:5)為溶媒對ICA進(jìn)行提取測定，發(fā)覺前者提取回收率小于60％，而后者即使提取回收率大于95％，但帶入雜質(zhì)峰較多，而且色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性下降。所以試驗(yàn)選取乙酸乙酯為提取溶媒，各生物樣品提取回收率均大于73％，且方法穩(wěn)定。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第73頁(9)藥品在生物樣品中穩(wěn)定性于各空白樣品中加入ICA標(biāo)準(zhǔn)品，配制成15ug/mL濃度樣品數(shù)份，置-20℃冰箱保留，分別于第0、5、15、30d按試驗(yàn)方法測定，RSD均小于7.1％。說明該藥品在各生物樣品中-20℃冰箱保留下，最少可穩(wěn)定1個月。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第74頁(10)血藥濃度測定為了檢驗(yàn)上述方法是否能滿足ICA藥代動力學(xué)研究，應(yīng)用本方法進(jìn)行了大鼠靜脈注射淫羊藿提取液。由大鼠頸靜脈按10mg/kg靜脈注射，于給藥后5，10，15，20，25，30，40，60，80，120，180min于頸靜脈各取血0.25mL，肝素抗凝，離心后取血漿0.1mL，按上述方法提取和測定ICA濃度，以給藥時間為橫坐標(biāo)，血漿中ICA對數(shù)濃度為縱坐標(biāo)繪制藥時曲線，見圖4-2。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第75頁血藥濃度測定結(jié)果表明，本文建立分析方法可滿足ICA藥代動力學(xué)研究需要，含有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第76頁例2：用RP-HPLC法同時測定依普黃酮及其代謝物M-I血漿濃度。1．試驗(yàn)方法(1)色譜條件檢測波長：254nm；色譜柱：WatersNova-PakC18柱(5um，3.9mm×150mm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L，pH值3.5)-乙腈(1:1)；流速：1.0mL/min；靈敏度：0.001AUFS；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10～20uL。體內(nèi)藥物分析方法和方法的設(shè)計和評價第77頁(2)溶液配制①標(biāo)準(zhǔn)液及內(nèi)標(biāo)液：精密稱取依普黃酮對照品10.00mg于10mL量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，精密量取此液1.00mL以流動相稀釋至50.0mL，使其成20mg/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃避光保留。精密稱取依普黃酮代謝物M-I對照品10mg，同法制成25mg/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃避光保留。另以