植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座

試驗(yàn)四、

過氧化氫酶活性測定

（高錳酸鉀滴定法）植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第1頁過氧化氫酶（CAT）普遍存在于植物全部組織中，其活性與植物代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測定。植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第2頁過氧化氫酶活性測定方法：氧電極法比色法化學(xué)發(fā)光法滴定法植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第3頁

過氧化氫酶屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？梢罁?jù)H2O2消耗量或O2生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多出過氧化氫。即可求出消耗H2O2量。

5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4

一、試驗(yàn)原理植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第4頁（一）材料：新鮮植物葉片（二）儀器設(shè)備：1.研缽；2.試管；3.酸式滴定管；4.恒溫水浴鍋；5.容量瓶/量筒。二、材料、儀器設(shè)備及試劑植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第5頁（三）試劑：1.10%H2SO4；2.0.2mol/LpH7.8磷酸緩沖液；3.0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液:KMnO43.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，再用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第6頁4.0.1mol/LH2O2：市售30%H2O2大約等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/LKMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；5.0.1mol/L草酸：稱取H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1000ml。植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第7頁（一）酶液提取：取植物葉片1g加入pH7.8磷酸緩沖溶液少許，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至20ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)至20ml容量瓶/量筒中，用同一緩沖液定容，４000rpm離心1５min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。三、試驗(yàn)步驟植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第8頁（二）取2個(gè)試管（一個(gè)測定，另一個(gè)對(duì)照），測定瓶加入酶液2.5ml，對(duì)照加煮死酶液2.5ml（100℃加熱2分鐘），再加入2.5ml0.1mol/LH2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30℃恒溫水浴中保溫15min，馬上加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/LKMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第9頁樣品對(duì)照酶液2.5ml酶液2.5ml（100℃加熱2分鐘）2.5ml0.1mol/LH2O22.5ml0.1mol/LH2O230℃恒溫水浴中保溫15min30℃恒溫水浴中保溫15min10%H2SO42.5ml10%H2SO42.5ml0.1mol/LKMnO4（Bml）0.1mol/LKMnO4

（Aml）植物生理實(shí)驗(yàn)四專家講座第10頁1.酶活性用每g鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2mg數(shù)表示：

過氧化氫酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×VT/(W×VS×1.7×t)式中：A對(duì)照KMnO4滴定ml數(shù)；B酶反應(yīng)后KMnO4滴定ml數(shù)；VT提取酶液總量（ml）；VS反應(yīng)時(shí)所用酶液量（ml）；W樣品鮮重（g）；t反應(yīng)時(shí)間（min）；1.71ml0.1mol/LKMn