膜片鉗實(shí)驗(yàn)與技術(shù)

膜片鉗實(shí)驗(yàn)與技術(shù)演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

在《膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用》（2003）一書(shū)的序言中寫(xiě)道：通常，一篇非常專(zhuān)業(yè)的科技論文公開(kāi)發(fā)表后，若被其他的論文引用數(shù)次，其作者就會(huì)感到欣慰；假如被別的作者引用十次以上，就可稱(chēng)得上是一篇好論文；要是有幸被引用幾十上百次，甚至幾百次，那它無(wú)疑是一篇高質(zhì)量杰作，通常發(fā)表在權(quán)威的專(zhuān)業(yè)期刊或者是著名的科學(xué)雜志上，如“Nature”，“Science”，“Cell”和“Neuron”等?，F(xiàn)在是2頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當(dāng)時(shí)還不太有名，刊登的雜志也不算頂級(jí)，可是論文發(fā)表20年來(lái)，已神話(huà)般地被世界各地的科技工作者引用了一萬(wàn)二千余次，遍及生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域，而且近年來(lái)還在以平均每年約一千多篇的速度繼續(xù)被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年發(fā)表在《歐洲生理學(xué)雜志》上的著名論文<ImprovedPath-ClampTechniguesforHigh-ResolutionCurrentRecordingfromCellsandCell-freeMembranePatches>。在此之前五年，身為德國(guó)科學(xué)家的Neher和Sakmann共同發(fā)明了膜片鉗技術(shù)（1976），并于15年后共同榮獲1991年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日目錄一、離子通道的概念二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)三、離子通道的分類(lèi)四、離子通道的研究技術(shù)五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法六、膜片鉗改良模式及其它研究方法現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日一、離子通道的概念

離子通道（ionchannels）是鑲嵌在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層上的一種特殊整合蛋白，在特定情況下，形成具有高度選擇性的親水性孔道，允許適當(dāng)大小和電荷的離子以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式通過(guò)?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門(mén)控特性。選擇性包括通道對(duì)離子大小的選擇性及電荷選擇性，如安靜時(shí)神經(jīng)細(xì)胞膜離子通道對(duì)K+的通透性比Na+大100倍，而神經(jīng)興奮時(shí)，對(duì)Na+通透性又比K+大10~20倍。通道閘門(mén)的開(kāi)啟和關(guān)閉過(guò)程稱(chēng)為門(mén)控（gating）。通道可表現(xiàn)為三種狀態(tài)，即備用、激活及失活狀態(tài)?，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)

隨著生物物理學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新的研究技術(shù)的應(yīng)用，特別是膜片鉗片技術(shù)與分子克隆、基因突變和異體表達(dá)等技術(shù)的結(jié)合，使離子通道的研究迅速進(jìn)入到分子、亞分子水平，人們已開(kāi)始有能力從分子水平來(lái)確定通道的分子結(jié)構(gòu)和解釋離子通道的孔道特性?，F(xiàn)在是8頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日１．電壓門(mén)控離子通道的基本結(jié)構(gòu)

經(jīng)純化、克隆和測(cè)定表明，離子通道蛋白是由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合體。電壓門(mén)控離子通道由α、β、γ、δ等亞基構(gòu)成，但不同的離子通道的組成略有差異，如鈉通道由α、β1、

β2和β3、

β4亞基組成，鈣通道由α1、α2、β、γ和δ亞基組成，鉀通道由α和β亞基組成等。在各亞基中，α亞基是構(gòu)成離子通道的主要功能單位，而其它亞基則只起調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

α亞基是一條跨膜多肽，由1800~2000個(gè)氨基酸組成。它包括四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Ⅰ~Ⅳ），每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有6個(gè)α螺旋片段（S1~S6）,除S4為親水性跨膜螺旋片段外，其余5個(gè)均為疏水性跨膜螺旋片段。位于S5和S6間的一段氨基酸序列部分貫穿膜內(nèi)，是形成親水性孔道而使離子選擇性通過(guò)的部分稱(chēng)為孔道區(qū)（poreregion）或P區(qū)，四個(gè)結(jié)構(gòu)域圍繞一個(gè)中心對(duì)稱(chēng)排列，P區(qū)在內(nèi)組成孔道內(nèi)壁。S4肽段含有一些帶正電荷的氨基酸殘基（如精、賴(lài)氨酸），對(duì)膜電位的變化敏感，起電壓感受器的作用?，F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

當(dāng)膜去極化時(shí)，每一個(gè)功能區(qū)的S4肽段做螺旋運(yùn)動(dòng)而使正電荷移出產(chǎn)生微弱而短暫的門(mén)控電流，導(dǎo)致通道構(gòu)象變化。當(dāng)四個(gè)結(jié)構(gòu)域S4肽段均發(fā)生這種構(gòu)象變化時(shí)，則通道便處于激活開(kāi)放狀態(tài)，因此，S4肽段又稱(chēng)為激活閘門(mén)（activationgate,m閘門(mén)）在通道開(kāi)放后，很快Ⅲ結(jié)構(gòu)域的S6與Ⅳ功能區(qū)的S1之間的肽鏈構(gòu)成失活閘門(mén)（inactivationgate,h閘門(mén)），形成一“活瓣”，將通道內(nèi)口阻塞，調(diào)控通道的失活過(guò)程。現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日２．化學(xué)門(mén)控離子通道的基本結(jié)構(gòu)

當(dāng)各種化學(xué)物質(zhì)與化學(xué)門(mén)控離子通道相應(yīng)部位結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致通道蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，引起通道開(kāi)放，產(chǎn)生離子電流。體內(nèi)這種離子通道的種類(lèi)很多，主要包括各種神經(jīng)遞質(zhì)門(mén)控離子通道、ATP敏感鉀通道和鈣依賴(lài)性鉀通道等。神經(jīng)遞質(zhì)門(mén)控離子通道又稱(chēng)為離子通道受體，主要有乙酰膽堿門(mén)控離子通道、GABA門(mén)控離子通道及谷氨酸門(mén)控離了通道三大類(lèi)。

現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日乙酰膽堿門(mén)控離子通道

由α1γα2βδ五個(gè)亞基組成，呈五邊形排列。每個(gè)亞基有4個(gè)跨膜區(qū)段即M1~4，由五個(gè)亞基的M2共同構(gòu)成孔道的內(nèi)壁。在α1和α2亞基N端的細(xì)胞外部分各有一個(gè)ACh結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)ACh分子與α亞基結(jié)合后，便引起通道蛋白的構(gòu)象變化和通道開(kāi)放，主要引起Na+內(nèi)流增多。現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日三、離子通道的分類(lèi)非門(mén)控離子通道門(mén)控離子通道電壓門(mén)控性通道化學(xué)門(mén)控性通道機(jī)械門(mén)控性通道現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日1、非門(mén)控性離子通道

有些離子通道始終處于開(kāi)放狀態(tài)，離子可隨時(shí)進(jìn)出細(xì)胞，并不受外界信號(hào)的明顯影響，這些通道稱(chēng)為非門(mén)控離子通道。如神經(jīng)和肌肉細(xì)胞靜息電位就是由于細(xì)胞膜上的離子通道允許K+自由進(jìn)出細(xì)胞，而引起的K+電化學(xué)平衡電位，此種K+通道即屬于非門(mén)控性離子通道。現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日2、電壓門(mén)控離子通道

電壓門(mén)控離子通道（voltage-gatedionchannels）又稱(chēng)電壓依賴(lài)性離子通道，這一類(lèi)通道的開(kāi)啟或關(guān)閉受膜電位的變化決定，具有電壓依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。電壓門(mén)控離子通道一般以最容易通過(guò)的離子命名，如鈉離子通道、鈣離子通道及鉀離子通道等?，F(xiàn)在是21頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

電壓門(mén)控鈉離子通道

鈉離子通道（sodiumchannels，簡(jiǎn)稱(chēng)鈉通道），是選擇性地容許Na+跨膜通過(guò)的離子通道。根據(jù)其對(duì)鈉通道阻滯劑河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）和μ-食魚(yú)螺毒素（μ-conotoxin,μ-CTX）的敏感性不同分為神經(jīng)類(lèi)、骨骼肌類(lèi)和心肌類(lèi)鈉通道三類(lèi)。

現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日電壓門(mén)控鈣離子通道

鈣離子通道（calciumchannels，簡(jiǎn)稱(chēng)鈣通道）是選擇性容許Ca2+跨膜通過(guò)的離子通道。根據(jù)肌細(xì)胞和神經(jīng)元電壓門(mén)控離子通道對(duì)膜電位變化的敏感性，將神經(jīng)元質(zhì)膜電壓門(mén)控鈣離子通道分為T(mén)、L及N三種類(lèi)型，后來(lái)應(yīng)用不同的毒素阻斷鈣電流的某種特定的成分，在神經(jīng)元又增加了P、Q和R型，共6型。現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日電壓門(mén)控鉀離子通道

鉀離子通道（potassiumchannels，簡(jiǎn)稱(chēng)鉀通道）是廣泛存在、種類(lèi)最多、最為復(fù)雜的一大類(lèi)離子通道，僅電壓門(mén)控鉀通道就已克隆出幾十種亞型，根據(jù)其電流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)可分為延遲外向整流鉀通道、瞬時(shí)外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道三類(lèi)?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日3、化學(xué)門(mén)控離子通道

化學(xué)門(mén)控離子通道（chemicallygatedionchannels）又稱(chēng)配體門(mén)控通道（ligandgatedchannels）。這一類(lèi)通道的門(mén)控行為主要受其相應(yīng)配體的控制，配體是包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素等各種激動(dòng)劑和阻滯劑在內(nèi)的多種化學(xué)因素。當(dāng)激動(dòng)劑與化學(xué)門(mén)控離子通道結(jié)合后，會(huì)引起通道蛋白構(gòu)型變化，導(dǎo)致通道開(kāi)放，產(chǎn)生離子電流?，F(xiàn)在是25頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日4、機(jī)械門(mén)控離子通道

機(jī)械門(mén)控離子通道（mechanicallygatedionchannels）是由機(jī)械牽拉激活的離子通道，主要見(jiàn)于觸覺(jué)和聽(tīng)覺(jué)感受器，如聲波傳入內(nèi)耳后，引起內(nèi)耳毛細(xì)胞頂端纖毛發(fā)生彎曲或偏斜，從而使毛細(xì)胞頂端機(jī)械門(mén)控通道開(kāi)放，陽(yáng)離子內(nèi)流產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)的感受電位。現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日5、其它門(mén)控離子通道除上述離子通道外，尚發(fā)現(xiàn)具有其它門(mén)控特性的離子通道存在，如細(xì)胞容積敏感的鉀通道（Kvol）在細(xì)胞腫脹時(shí)通道開(kāi)放；Na+激活鉀通道（KNa）對(duì)電壓、細(xì)胞內(nèi)ATP濃度及細(xì)胞內(nèi)鈣均不敏感，只有細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高到20mmol/L以上時(shí)開(kāi)放；存在于多種肌細(xì)胞的靜息活化鈣通道，在沒(méi)有電壓、化學(xué)或機(jī)械刺激時(shí)，參與靜息鈣內(nèi)流，調(diào)制靜息時(shí)的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日四、離子通道的研究技術(shù)現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日1、電壓鉗技術(shù)

電壓鉗技術(shù)是1949年Cole及Marmont設(shè)計(jì)的，后經(jīng)Hodgkin、Huxley和Katz等加以改進(jìn)，并成功地應(yīng)用于槍烏賊巨軸突動(dòng)作電位期間離子電流的研究。他們直接測(cè)定了膜電流并分析了電流的離子成分，推算出動(dòng)作電位期間鈉電導(dǎo)和鉀電導(dǎo)的變化，其基本概念至今仍被沿用。鑒于Hodgkin、Huxley和Eccles對(duì)通道研究的突出貢獻(xiàn)，獲得1963年諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)?，F(xiàn)在是29頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日A.L.Hodgkin1914~1998A.F.Huxley

1917~現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

電壓鉗技術(shù)是通過(guò)一個(gè)反饋電路使膜電位保持在指定的水平，當(dāng)離子通道開(kāi)放產(chǎn)生跨膜電流，導(dǎo)致膜電位改變時(shí)，可通過(guò)反饋電路經(jīng)微電極向胞內(nèi)注入電流，補(bǔ)充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，使膜通透性發(fā)生改變時(shí)膜電位保持不變，此時(shí)注入電流的變化就可反應(yīng)膜電導(dǎo)或膜電流的改變。電壓鉗技術(shù)工作原理如示意圖：現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日2、膜片鉗技術(shù)1976年Neher和Sakmann完成電極與膜之間50MΩ的封接，首次記錄到去神經(jīng)蛙肌纖維膜上的單通道電流，為證實(shí)生物膜離子單通道是以全或無(wú)規(guī)律、隨機(jī)開(kāi)放關(guān)閉的假說(shuō)提供了有力依據(jù)。但是，當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)記錄的背景噪聲較大。1980年，Neher利用負(fù)壓吸引實(shí)現(xiàn)了GΩ封接，背景噪聲顯著減低。1991年膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)始人Neher和Sakmann榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日PatchclampErwinNeherBertSakmann1944~1942~現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日膜片鉗技術(shù)是用尖端直徑1~2μm的玻璃微電極吸管與經(jīng)蛋白酶處理干凈的細(xì)胞膜接觸，通過(guò)20~30cmH2O的負(fù)壓吸引造成電極尖端與細(xì)胞膜形成高阻封接（10~100GΩ），使電極尖端下的小塊膜片與膜的其它部分在電學(xué)上絕緣，并在此基礎(chǔ)上固定膜片電位，監(jiān)測(cè)幾個(gè)μm2膜片上1~3個(gè)離子通道活動(dòng)的方法。膜片鉗技術(shù)可用一根玻璃微電極同時(shí)完成膜片（或全細(xì)胞）電位的監(jiān)測(cè)、鉗制及通道電流的記錄?，F(xiàn)在是36頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日膜片鉗技術(shù)具有1pA的電流分辨率，10μs的時(shí)間分辨率和1μm2的空間分辨率，使其成為在活體細(xì)胞上進(jìn)行電生理學(xué)研究的重要手段。隨著該技術(shù)的逐漸完善及應(yīng)用，目前已成為從功能角度探討各種生理、病理生理及藥物作用機(jī)制最直接、最理想的電生理學(xué)研究方法，也為多學(xué)科探討生命活動(dòng)規(guī)律、疾病與轉(zhuǎn)歸機(jī)理及藥物作用等細(xì)胞和分子水平的研究，開(kāi)辟了廣泛前景。現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

3、膜片鉗記錄的模式

根據(jù)研究需要及記錄膜片的不同，膜片鉗記錄可形成以下四種基本模式

1.細(xì)胞貼附式（cellattachedpatch）

2.內(nèi)面向外式（inside-outpatch）

3.外面向外式（outside-outpatch）

4.全細(xì)胞記錄式（wholecellrecording）

現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

4、膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的組建

膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺(tái)和屏蔽罩等。

現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日視頻監(jiān)視器溫度控制系統(tǒng)倒置顯微鏡探頭微操縱器模數(shù)轉(zhuǎn)換器膜片鉗放大器數(shù)據(jù)采集及分析軟件計(jì)算機(jī)現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法

膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法包括：微電極的制備細(xì)胞標(biāo)本的制備高阻封接的形成離子單通道電流的記錄或全細(xì)胞記錄現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日1、微電極的制備微電極是用拉制器由玻璃毛細(xì)管拉制而成。玻璃微電極的選材和拉制質(zhì)量直接影響封接電阻及記錄時(shí)的噪聲大小。

（1）選材膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極可根據(jù)不同記錄模式選用不同的玻璃毛細(xì)管拉制。從玻璃毛細(xì)管材料方面,可分為軟質(zhì)玻璃和硬質(zhì)玻璃兩類(lèi)?，F(xiàn)在是47頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日（2）拉制膜片鉗實(shí)驗(yàn)用微電極與細(xì)胞外記錄和細(xì)胞內(nèi)記錄用微電極不同，其尖端較短，錐度較大，尖端直徑為1~5μm，充灌林格氏液時(shí)阻抗約1~5MΩ，因此一般采用兩步拉制法。第一步將玻璃軟化，拉出一個(gè)長(zhǎng)7~10mm、直徑200~400μm的桿，第二步再?gòu)臈U中央以較小電流拉出兩根尖端錐度較大的微電極?，F(xiàn)在是48頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日（3）處理微電極拉制成功后，其尖端需進(jìn)一步處理。這一過(guò)程包括涂硅酮樹(shù)酯（sylgardcoating）和熱拋光（heatpolish）。前者是將硅酮樹(shù)酯涂于微電極尖端以外部分，達(dá)到使浸入浴液中的微電極表面呈疏水性，減小電極內(nèi)部與溶液之間的電容。熱拋光是在顯微鏡下，將微電極尖端接近熱源（通電加熱的鉑絲或白金絲等），使電極尖端表面變得更加寬闊和光滑，經(jīng)熱拋光處理的微電極可使高阻封接的成功率明顯提高?，F(xiàn)在是49頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日（4）充灌微電極使用前要充灌電極內(nèi)液，電極內(nèi)液需經(jīng)0.2μm的濾膜或?yàn)V紙過(guò)濾。充灌時(shí)首先將電極尖端浸入電極內(nèi)液，利用虹吸作用使尖端部分充滿(mǎn)液體，然后再?gòu)碾姌O尾端充灌。在充灌中應(yīng)避免電極內(nèi)出現(xiàn)氣泡，如有氣泡可使電極尖端向下，輕敲管壁除去。也應(yīng)避免充灌電極內(nèi)液太多，否則影響實(shí)驗(yàn)噪聲基線(xiàn)?，F(xiàn)在是50頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日2、細(xì)胞標(biāo)本的制備除腦片膜片鉗和盲膜片鉗法之外，實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)本均為具有生物活性的離體細(xì)胞，其來(lái)源包括急性分離、原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。從理論上來(lái)講，膜片鉗實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞標(biāo)本可來(lái)自體內(nèi)各種組織細(xì)胞，只要細(xì)胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標(biāo)本制備上，不同組織細(xì)胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機(jī)械分離以及清洗等步驟。現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日3、高阻封接的形成

高阻封接形成與否是記錄細(xì)胞離子通道電流能否成功的前提，是進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵一步。微電極尖端與細(xì)胞膜形成封接的過(guò)程，可以采用軟件或刺激器發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過(guò)示波器或顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來(lái)確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器或示波器上可見(jiàn)一直線(xiàn)。

現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日進(jìn)行高阻封接時(shí)，需注意的是：①在微電極未入液之前常施以正壓，防止浴液表面灰塵或溶液中粒子附著于電極尖端，影響高阻封接。②電極尖端與細(xì)胞膜接觸，稍加負(fù)壓后電流波形變得平坦，此時(shí)，如使電極超極化，則有助于加速形成高阻封接。③電極入液后封接的成功率與入浴液后的時(shí)間呈反比，電極內(nèi)液中的肽類(lèi)或蛋白質(zhì)成分也會(huì)有礙于封接形成?，F(xiàn)在是54頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日4、離子通道電流的記錄現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

單通道電流記錄

離子單通道電流的記錄是膜片鉗技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)，當(dāng)尖端直徑為1μm的玻璃微電極與細(xì)胞膜形成高阻封接后，根據(jù)單通道電流的特征，很容易得到對(duì)某種離子有選擇性通透的單一的離子通道電流。由于單通道電流大小僅為1pA（10-12A）左右，要記錄到這一微小電流，除盡量降低膜片鉗系統(tǒng)噪聲及電極噪聲外，良好的高阻封接是獲得低噪聲記錄的先決條件。現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

全細(xì)胞電流記錄

全細(xì)胞記錄是膜片鉗四種基本模式之一。盡管它記錄的是細(xì)胞膜多個(gè)離子通道開(kāi)放產(chǎn)生的宏膜電流，但由于該模式既可以對(duì)離子通道的性質(zhì)和分類(lèi)進(jìn)行宏觀性質(zhì)的分析，也可以對(duì)離子通道的構(gòu)造、分布與功能進(jìn)行微觀性質(zhì)的分析，從而使其成為當(dāng)前電生理研究中應(yīng)用最廣泛的一種模式。現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

全細(xì)胞記錄模式可用于測(cè)定在某個(gè)時(shí)間和電壓情況下，離子通道電流的大小，觀察其電壓依賴(lài)性特征，如以膜電位為橫座標(biāo)，電流強(qiáng)度為縱座標(biāo)，則可繪制出電流-電壓關(guān)系曲線(xiàn)（I-V曲線(xiàn)）。在電流為零時(shí)的膜電位被稱(chēng)為反轉(zhuǎn)電位。I-V曲線(xiàn)和反轉(zhuǎn)電位反映了某種通道的電壓依賴(lài)性及藥物等因素對(duì)通道電壓依賴(lài)性的影響，常作為全細(xì)胞記錄模式結(jié)果分析的指標(biāo)之一。

現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

鈉通道的激活是電壓門(mén)控的，當(dāng)細(xì)胞膜去極化至-60mV左右時(shí)，即可引起膜上大量鈉通道激活，產(chǎn)生一迅速激活并迅速失活的內(nèi)向電流，當(dāng)去極化至-30mV左右時(shí)達(dá)到最大，反轉(zhuǎn)電位為+30mV左右。在參數(shù)設(shè)計(jì)上應(yīng)使保持電位鉗制在-80mV以下，此時(shí)給予不同程度的去極化階躍電壓，則可得到鈉電流，由于鈉通道激活和失活均很快，因此刺激脈沖波寬常為20~50ms。

鈉通道電流的測(cè)定現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

為證實(shí)所測(cè)電流為鈉電流，常借助于工具藥，如河豚素（TTX）用于細(xì)胞外液中，可以選擇性阻斷鈉通道。由于神經(jīng)與心臟中的鈉通道亞型不同。心肌鈉通道對(duì)TTX的敏感度比神經(jīng)低數(shù)百倍。當(dāng)膜電位鉗制在-80mV，去極化中還可能引起某些鉀通道成分的激活，此時(shí)可使用鉀通道阻斷劑或?qū)㈦姌O液中KC1以CsC1取代可起到抑制鉀通道激活的作用。現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

鈣通道電流的測(cè)定（1）L型鈣通道:

膜電位鉗制在-60mV，這樣即較大程度的激活了L型鈣通道，又有效的抑制了鈉通道；激活與失活時(shí)間較長(zhǎng)，因此去極化脈沖的保持時(shí)間在200~500ms之間；L型鈣通道的最大電流約在0~+10mV；反轉(zhuǎn)電位為+40~+50mV左右。

L型鈣通道除對(duì)二氫吡啶、Verapamil以及硫氮卓酮等鈣拮抗劑敏感外，對(duì)某些無(wú)機(jī)離子如Cd2+也很敏感，20μMCd2+就可使鈣通道活性抑制90%以上，常被用作全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)中的工具藥。現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

值得注意的是，L型鈣通道電流測(cè)定時(shí),可隨時(shí)間產(chǎn)生衰減,即所謂run-down現(xiàn)象。盡管許多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，但仍不能有效地防止這一現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)在10分鐘之內(nèi)就可使鈣電流減少30~50%。如不加以矯正，則直接影響結(jié)果的可靠性，尤其是給藥前后的對(duì)比，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，必須考慮到這一因素，并設(shè)立嚴(yán)格的對(duì)照組?，F(xiàn)在是72頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日（2）T型鈣通道:①激活所需的膜電位較低,通常為-100~-60mV。此差別常用來(lái)與L型鈣通道進(jìn)行鑒別，如將膜電位鉗制在-40mV時(shí)，去極化只能得到L型鈣電流，因T型通道已被完全抑制。②當(dāng)有鈉通道和鉀通道拮抗劑存在時(shí)，膜電位被鉗制在-100mV時(shí)，進(jìn)行不同程度的去極化，所得到的內(nèi)向電流可分為兩種成分，即快速失活的T型鈣通道電流和緩慢失活的L型鈣通道電流。③T型鈣通道對(duì)雙氫吡啶類(lèi)鈣拮抗劑均不敏感，Cd2+對(duì)其抑制也不明顯?，F(xiàn)在是74頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日（3）N型鈣通道則僅存在于神經(jīng)細(xì)胞和突觸部位，這種通道激活時(shí)，所需的膜電位與T型鈣通道相似，范圍在-100~-40mV。此型電流不能被二氫吡啶類(lèi)鈣拮抗劑所抑制，但可被較低濃度的Cd2+所阻斷。ω-CTX是其具有相對(duì)特異性的拮抗劑?，F(xiàn)在是75頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日

鉀通道電流的測(cè)定

鉀通道是亞型最多、分布最廣的一大類(lèi)離子通道，現(xiàn)在已知并具有明確功能及動(dòng)力學(xué)特性的鉀通道就有十多種，各種鉀通道亞型的特征電流不如鈉或鈣通道電流明顯，因此在研究中要根據(jù)它們的電壓及時(shí)間依賴(lài)性，選擇恰當(dāng)?shù)拇碳げ襟E及時(shí)間，配合特定工具藥進(jìn)行區(qū)分?，F(xiàn)在是76頁(yè)\一共有89頁(yè)\編輯于星期日（1）內(nèi)