固定化木瓜蛋白酶與溶液酶性質(zhì)的比較1

/固定化木瓜蛋白酶與溶液酶性質(zhì)的比較學(xué)生姓名劉晶指導(dǎo)老師萬(wàn)善霞摘要：本文就木瓜蛋白酶固定化后的性質(zhì)與其溶液酶性質(zhì)進(jìn)行了初步比較。以變性的卵清蛋白為載體，以戊二醛做交聯(lián)劑固定木瓜蛋白酶。結(jié)果表明:與溶液酶相比，固定化后的木瓜蛋白酶最適反應(yīng)溫度提高了30℃，最適反應(yīng)PH向堿性方向移動(dòng)2.0，其熱穩(wěn)定性及耐熱性均較溶液酶有顯著提高關(guān)鍵詞：木瓜蛋白酶；固定化;卵清蛋白；戊二醛ComparisｏnoftheprｏpeｒｔiesｉｍｍobiｌizeｄpａpainandsolｕbｌｅpaｐａinLiuJinｇWanＳｈanxｉaＡbstrａcｔ:Ｉnthispａｐeｒ,theiｍmobｉｌiｚeｄpaｐａｉnｗiththenatureofaｐｒeliｍinarｙｎaｔureoｆthｅsolｕbleｐａpaｉncｏｍpared。Toｄｅnaturedeggwhiteproteinastｈeｓuppoｒtwiｔhgluｔａｒaldeｈydeaｓthｅcrosｓ-liｎｋer.Theresultsｈowｅｄthａｔ:coｍpａｒｅdwithｔhesolublepapａｉn，ｉmmobiliｚeｄpａpainｉncｒｅasｅdtｈeoｐtimumｔemperａt(yī)urｅ30℃，optimｕｍPH2.0ｔotｈeｂasicdｉrｅcｔion,ThｅthｅrmｏstａbｉliｔyanｄthermotolｅraｎceoftｈeｉmmobilizeｄpapainareｏｂviｏuslｙincreasedｃomparｅdtoｔhoseofthｅsolｕbｌeKeyｗｏrds:papain；ｉmmoｂilｉｚatiｏｎ;egｇｗhiteproｔein;glutaralｄehyde目錄ＴO(shè)C\ｏ"１-3"\h＼ｚ\ｕHYPERＬIＮK＼l”＿Toc19９24１76６"１.序言‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5HＹPＥＲＬINK＼l”＿Toｃ19９２41767"2。實(shí)驗(yàn)材料‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5HYPERＬINK\l＂_Ｔｏc1992４1768”2．1儀器及器材‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5HYPERLＩNＫ\l＂_Tｏｃ1992４1769"2。2實(shí)驗(yàn)試劑‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥6ＨYPERＬINK\l”_Ｔoc199241774”3。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥6HYPERLINK\ｌ"_Toc1９924177５"3。1實(shí)驗(yàn)測(cè)定原理 6HＹＰERLINK＼l"_Ｔoc1992４17７６"3.2固定化酶與溶液酶最適溫度的比較?７HYPEＲLINK\ｌ”＿Tｏc１992４１7７７"3．2。１實(shí)驗(yàn)方法?7３。2。1。１試劑組成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥73。2。1。２木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥73.２．1。３木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測(cè)‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7３。2.1。4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥8HYＰERLINK\l”_Toｃ199２41778＂３.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥9３。2．２。１實(shí)驗(yàn)結(jié)果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥９3．2.２．2結(jié)果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥10ＨＹPERLINK\l"_Ｔoc199２41779＂3.３固定化酶與溶液酶最適PＨ的比較?１0HＹPＥRLIＮK\ｌ"＿Toc1９9241777＂3．3．1實(shí)驗(yàn)方法 103．3．１．１試劑組成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥１03.3。１。2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113。3。1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測(cè)‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113．3．１.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11HYＰEＲLINK3.4．1試驗(yàn)方法?123。４.1．１試劑組成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥1２3．4。1。2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥123．４.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測(cè)‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥133.４。1．4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥14HＹPＥＲLINK\l＂_Toｃ199２4１７８4”3．4．2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 １43。4.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥14３.4.２。２結(jié)果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥15HYPERLINK\l”_Ｔoc1９9241785＂3．５固定化酶與溶液酶耐熱性的比較 １5HYPEＲＬＩNK\l＂＿Ｔoc１99２4１7８6＂３.５．1試驗(yàn)方法 1５３。５．1.1試劑組成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥１53．5。1。２木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153。5.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測(cè)‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153．5。1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥16ＨYＰＥRLＩNK＼l"_Toc１9９241787"３.5．2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 16３．５。2。１實(shí)驗(yàn)結(jié)果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥1６3。5.2.２結(jié)果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥１6ＨＹPERＬINK4.討論?17HＹPERＬINK\l"_Tｏc１9９２41798”5。結(jié)論?17HYPERＬINＫ＼l"_Toc199241７９9”參考文獻(xiàn)?１8HＹＰEＲLINK\ｌ”＿Tｏc1９9241８00＂致謝?１91.序言木瓜蛋白酶（Papａin）簡(jiǎn)稱(chēng)木瓜酶,又稱(chēng)為木瓜酵素。木瓜蛋白酶由２12個(gè)氨基酸殘基組成，并含有3對(duì)二硫鍵，是一種含疏基（—SＨ）肽鏈的內(nèi)切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,具有較廣泛的特異性［1］.它的三維結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域所組成，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成一個(gè)縫隙；縫隙內(nèi)含有酶的活性位點(diǎn),包括一個(gè)催化三聯(lián)體,與胰凝乳蛋白酶中所含的相似。木瓜蛋白酶中的催化三聯(lián)體由25位的半胱氨酸(Ｃys-２5）、1５9位的組氨酸（Hiｓ—１5９）和1５8位的天冬酰胺（Aｓn-158）這三個(gè)氨基酸所組成[２]。木瓜蛋白酶是一種重要的生化產(chǎn)品，它已被廣泛應(yīng)用于食品、美容化妝品、醫(yī)藥保健品、日化品、飼料、皮革、紡織等多個(gè)行業(yè)，有效提高產(chǎn)品的質(zhì)量和檔次，降低生產(chǎn)成本。木瓜蛋白酶的固定化始于20世紀(jì)60年代初，但多數(shù)方法不是因?yàn)椴牧蟻?lái)源困難，就是因?yàn)樵噭┒拘暂^大而影響了其在工業(yè)上應(yīng)用。Kaｍata［3]曾報(bào)道過(guò)廉價(jià)的卵清蛋白做載體來(lái)固定化胰蛋白酶和α—淀粉酶。但這種方法操作相對(duì)繁瑣,必需先對(duì)卵清蛋白進(jìn)行糖基化,再將糖基化后的載體與酶進(jìn)行固定，并且糖基化后的載體容易溶解，從而導(dǎo)致固體化酶的回收率偏低。本文以此為基礎(chǔ)，載體直接選用變性的卵清蛋白，結(jié)合傳統(tǒng)的交聯(lián)固定法,用戊二醛做交聯(lián)劑,成功的固定了木瓜蛋白酶，簡(jiǎn)化了操作步驟。用卵清蛋白固定化的木瓜蛋白酶在耐熱性、熱穩(wěn)定性、耐酸堿等方面都較溶液酶有明顯提高。這為木瓜蛋白酶的固定和提供一種新的途徑，為擴(kuò)大其在工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定技術(shù)依據(jù)。2.實(shí)驗(yàn)材料2。1儀器及器材ＵV-21０0型紫外分光光度儀Saｒtｏrius電子分析天平三溫三孔水浴鍋HZQ－C型空氣浴震蕩儀海爾4℃移液槍DNP－9０52型電熱恒溫培養(yǎng)箱WG-71型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱PＨ綜合測(cè)試儀試管和試管架；燒杯；玻璃棒;量筒；漏斗；研缽；200ml離心管;１50ｍl離心管；石英比色皿;移液槍槍頭;2。２試劑木瓜蛋白酶（０.5—２uｎiｔs/ｍg）半胱氨酸乙二胺四乙酸EＤTA硫酸氫二鈉（分析純)磷酸二氫鈉(分析純)戊二醛２5％（生化試劑)氫氧化鈉(分析純)干酪素(棕色瓶子保存)三氯乙酸（TCＡ)3實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果3.1實(shí)驗(yàn)測(cè)定原理本試驗(yàn)采用以酪蛋白為底物的紫外分光光度法測(cè)定木瓜蛋白酶的活性。木瓜蛋白酶分解酪蛋白的產(chǎn)物為酪氨酸共軛雙鍵，在２80nm處，檢測(cè)酪氨酸共軛雙鍵的吸光系數(shù),酶的單位定義為每分鐘吸光值增加0.０１所需的酶量。對(duì)于木瓜蛋白酶的固定，則用變性的卵清蛋白直接作為載體,結(jié)合傳統(tǒng)的交聯(lián)固定法，用戊二醛作交聯(lián)劑,形成共價(jià)鍵,成功地固定了木瓜蛋白酶,主要是基于經(jīng)濟(jì)效益和安全兩個(gè)方面的考慮。首先，卵清蛋白體的獲得及制備十分容易,且成本低。另外，在食品和醫(yī)藥的用用中，卵清蛋白載體無(wú)毒性問(wèn)題,這是產(chǎn)品的安全性大大提高；戊二醛又最常用的交聯(lián)劑之一,交聯(lián)效果穩(wěn)定,并且簡(jiǎn)化了操作步驟。因此,這種固定化木瓜蛋白酶的方法可取。3.2固定化酶溶液酶最適溫度的比較3．2。１實(shí)驗(yàn)方法3．2.１.1試劑組成木瓜蛋白酶1.６mｇ/mｌ酪蛋白5ｍg/mｌ三氯乙酸１５％戊二醛5%磷酸緩沖液（0。2ｍol/L的pH7。0的磷酸緩沖液中含30mmol/L半胱氨酸和0.6mｍｏl／LＥDTA,)3.2。１.2木瓜蛋白酶的固定化參考相關(guān)文獻(xiàn)可知［４］，以卵清蛋白為載體固定化木瓜蛋白酶的最佳條件.取定量的雞蛋清,按１∶3的比例加入蒸餾水，于100℃水浴攪拌加熱使其變性成膠狀，于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干，研細(xì),以此作為載體。取1g的載體,加入１０mｇ的木瓜蛋白酶,隨后加入pＨ６的磷酸緩沖液及5％戊二醛溶液,用電熱恒溫培養(yǎng)箱混勻，振蕩20小時(shí)，過(guò)濾，將固定后的酶用pH63.2。１.３木瓜蛋白酶溶液酶活力的檢測(cè)稱(chēng)取0．１6g木瓜蛋白酶(０。5—2unｉts/ｍｇ),溶于０.2ｍol／Ｌ、ｐH7.０的磷酸緩沖液并定容至100mL,過(guò)濾，制得1.6mg／ｍl的木瓜蛋白酶溶液，用比色法測(cè)定酶活力.在0。1mL1。6mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中加入0.9mＬ磷酸緩沖液（0.2ｍol／Ｌ的pH7。０的磷酸緩沖液中含30mmｏｌ／L半胱氨酸和0.６ｍmol/LEDＴA,現(xiàn)配現(xiàn)用），分別于30℃、４0℃、50℃、6０℃、70℃、80℃、９0℃、100℃水浴恒溫10ｍin，加入相應(yīng)溫度恒溫預(yù)熱的5mg/mL的酪蛋白溶液1mＬ（0.2ｍol/LｐH7.０的磷酸緩沖液配制）,相應(yīng)溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)１０mｉn，立即加入15%三氯乙酸(ＴCA）溶液3mL終止反應(yīng),對(duì)照則先加TCＡ終止反應(yīng),再加5mｇ/mL的酪蛋白溶液1ｍL，其余與測(cè)定管相同.表1木瓜蛋白酶溶液酶加樣順序管號(hào)0（對(duì)照）1(樣品）２（樣品)酶液（ml）0.10。10。1激活劑（ml）1。01．０１.0恒溫預(yù)熱10分鐘酪蛋白(ml）０1。０1．０恒溫水浴10分鐘15％TCA（ｍl）3。03．0３．０酪蛋白（ml）１。００0搖勻，靜置１０分鐘過(guò)濾ＯＤ2８0nm０。0０0３。2.１。4固定化酶活力的測(cè)定在試管中加入1。0mＬ0.1mｏｌ/L，pＨ７。0的磷酸鹽緩沖溶液(含3０mｍｏｌ/Ｌ半胱氨酸和０。6mｍol/LＥＤTＡ,)，分別于30℃、4０℃、５0℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃預(yù)熱5mｉn,加入0.01g的固定化酶，隨后加入1．0ｍL酪蛋白溶液。于相應(yīng)溫度水浴中震蕩反應(yīng),10min后立即加入３表２木瓜蛋白酶溶液酶加樣順序管號(hào)０（對(duì)照）1（樣品)2(樣品）激活劑(ml）1．01．０1。0恒溫預(yù)熱5分鐘固定化酶（ｇ）0.010。0１0.０1酪蛋白（ml)0１．０1．0恒溫水浴1０分鐘1５％TCＡ(ml）3．03。０３。0酪蛋白(ml）1.０00搖勻，25℃OＤ280nｍ０.００03。2。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析3．2.2．1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表３不同溫度下，固定化木瓜蛋白酶與其溶液酶活性酶酶組溫度溶液酶固定化酶第一組第二組第三組平均值第一組第二組第三組平均值30０．0１10．００90。０120．0１10.0090.０080。０1００。009400．0500．0470。０470。０480。0１２０.01２0.01０0．01250０。0670。０６7０．0650.0６50．0230.02５0.02４０.02460０.1030.1010.1020.1０20.0３１０．0３30．03２0．0３2７00.