熒光定量技術(shù)專題

熒光定量技術(shù)專題第1頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南第2頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測熒光定量PCR原理－－定義第3頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念第4頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺期熒光基團(tuán)熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線第5頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過閾值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光閾值平臺期第6頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值第7頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性Ct值的重現(xiàn)性第8頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理第9頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理第10頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：Log2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理第11頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系第12頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)Notemplatecontrol確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率:-3－-3.535Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）:0.9-1.2第13頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南第14頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日非特異性熒光標(biāo)記

SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記TaqManProbe常用熒光標(biāo)記方法第15頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI第16頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——作用機(jī)理第17頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日問題點(diǎn)：SYBRGreenI與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時(shí)被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBRGreenI染料法——問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)：

設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！第18頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線第19頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確SYBRGreenI染料法——融解曲線第20頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針具有價(jià)格優(yōu)勢優(yōu)點(diǎn)

無模板特異性對引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量靈敏度相對較低缺點(diǎn)SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點(diǎn)第21頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日Taqman探針法——原理

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第22頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日Taqman探針法——工作機(jī)理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR第23頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日1、引物、探針的設(shè)計(jì)：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：100-900nM

探針濃度：50-300nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立第24頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日

高度特異性重復(fù)性好靈敏度高可進(jìn)行多重定量優(yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)Taqman探針法——優(yōu)缺點(diǎn)第25頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)第26頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日FRET實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)第27頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日高特異性：對目標(biāo)序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)

只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類－－分子信標(biāo)第28頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日

幾種方法的應(yīng)用比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標(biāo))高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析第29頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，

GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用第30頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日內(nèi)容概要熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR的原理熒光定量PCR解析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南第31頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日絕對定量解析方法第32頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量第33頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日一個(gè)目的基因——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本——用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔–——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線（探針法不需要）。絕對定量分析幾要素第34頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA第35頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日拷貝數(shù)的計(jì)算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算第36頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量檢測

試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）

標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105、104、103；2個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對照

實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBVDNA；設(shè)計(jì)特異引物；設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針；熒光定量擴(kuò)增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對定量實(shí)驗(yàn)例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第37頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標(biāo)準(zhǔn)品5×10328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品5×10425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品5×10522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)絕對定量實(shí)驗(yàn)例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第38頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日擴(kuò)增效率（E）計(jì)算E=10-1/斜率

－1=10-1/-3.29

－1

=2.01－1=1.01標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.29x+40.33R2=0.9978絕對定量實(shí)驗(yàn)例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.9-1.2,越接近1，越理想。第39頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03

=1,071,519copies絕對定量實(shí)驗(yàn)例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-40.33-3.29=6.03第40頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日相對定量解析方法第41頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日理論上目的基因表達(dá)量分析條件SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實(shí)際目的基因表達(dá)量分析相對定量的必要性第42頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日相對定量分析方法比較兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本中某個(gè)基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點(diǎn)：基因的相對表達(dá)量，而不是基因的絕對量！第43頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日一個(gè)參照樣本一個(gè)或一個(gè)以上的未知樣本一個(gè)目的基因管家基因——用來校對不同樣本之間目的基因的實(shí)際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔–——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）相對定量分析幾要素第44頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日管家基因

維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實(shí)驗(yàn)篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

第45頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析——兩種常用的分析方法第46頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對值即為相對表達(dá)量。

相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：第47頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對簡單缺點(diǎn)：對每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一相對定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)第48頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日相對定量分析——2法－△△CtXT是目標(biāo)分子達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)RT是內(nèi)參分子達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)

假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：

或最后用任一樣本q的XN除以參照因子（calibrator，cb）的XN得到：

對于一個(gè)少于150bp的擴(kuò)增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于1。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是：

第49頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)點(diǎn)：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜。應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一待測組目的基因平均Ct值待測組內(nèi)參基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組內(nèi)參基因平均Ct值－－－－△△Ct第50頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在處理后表達(dá)水平是處理前的5.3倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計(jì)算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析——2-△△Ct法第51頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日內(nèi)容概要熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR的原理熒光定量PCR解析方法SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南第52頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)樣品制備定量體系配備引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法第53頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計(jì)檢測電泳檢測第54頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日RT反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMVM-MLVQuant下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇高效、全長的cDNASYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)第55頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日定量體系配備引物設(shè)計(jì)濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個(gè)堿基重復(fù)＜4個(gè)無二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：100－200bp第56頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長度決定反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化Mg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)擴(kuò)增效率：90％－110％重復(fù)性：std＜0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＞0.99或R2＞0.98SYBR法實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照第57頁，共65頁，2023年，2月20日，星期日技能要求誤差控制儀器介紹上機(jī)試劑選擇RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO