內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座

內(nèi)容基本概念試驗(yàn)方法操作注意事項(xiàng)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第1頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁產(chǎn)物,它主要化學(xué)成份是脂多糖。細(xì)菌在生活狀態(tài)下不會(huì)釋放出來(lái)，只有當(dāng)細(xì)菌死亡后才會(huì)表現(xiàn)出毒性。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第2頁(yè)一、概念及相關(guān)知識(shí)熱原反應(yīng)：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)燒、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何能夠造成肌體發(fā)燒物質(zhì)。機(jī)理：外源性熱原質(zhì)經(jīng)過(guò)內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。外源性熱原質(zhì)吞噬性白細(xì)胞內(nèi)源性熱原質(zhì)體溫調(diào)整中心發(fā)熱新蛋白合成新mRNA翻譯內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第3頁(yè)1942年，美國(guó)藥典首次收載熱原檢驗(yàn)法，中國(guó)藥典自第一版（1953年版）起收載。全部注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經(jīng)過(guò)熱原檢驗(yàn)。熱原檢驗(yàn)法不足：1、重現(xiàn)性差。2、對(duì)藥品引發(fā)增加、抑制作用無(wú)法控制。3、不一樣細(xì)菌產(chǎn)生熱原質(zhì)致熱域有差異。4、非定量反應(yīng)。即使不排除有其它熱原物質(zhì)存在，但細(xì)菌內(nèi)毒素是最主要熱原物質(zhì)。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第4頁(yè)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)：肽聚糖脂蛋白革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陰性菌外膜磷壁酸脂多糖細(xì)菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中脂多糖（LPS）。當(dāng)細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)完整時(shí)不具備生物活性，只有當(dāng)細(xì)菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原＋關(guān)鍵多糖＋類脂A致熱活性部分內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第5頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素生物活性

1、致熱性。2、致死性毒性。3、白細(xì)胞降低。4、激活凝血系統(tǒng)。5、降低血壓，休克。6、Shwartzman反應(yīng)。7、刺激淋巴細(xì)胞有絲分裂，等等。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第6頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素耐熱性細(xì)菌內(nèi)毒素具很強(qiáng)耐熱性，普通高壓滅菌不能去除細(xì)菌內(nèi)毒素，需250℃最少30分鐘以上干熱滅菌才能使其滅活。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第7頁(yè)試驗(yàn)用器具處理

內(nèi)毒素試驗(yàn)中使用器皿都要經(jīng)過(guò)處理去除可能存在外源性內(nèi)毒素。耐高溫玻璃器皿等置于電熱干烤箱內(nèi)180℃干烤最少2h或者250℃干烤最少30分鐘；塑料器皿置于30％雙氧水中浸泡4h，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水充分沖洗，60℃烘干備用。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第8頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素單位內(nèi)毒素量值：1、內(nèi)毒素單位（EU）1982年FDA將當(dāng)初美國(guó)代號(hào)為EC－2內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品要求為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國(guó)際單位（IU）WHO先后兩次組織協(xié)作標(biāo)定，建立內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，其中第二批內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品適合用于全部?jī)?nèi)毒素檢驗(yàn)法，且明確1IU＝1EU。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第9頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法凝膠法濁度法光度法顯色基質(zhì)法重現(xiàn)性好能定量能控制藥品增強(qiáng)/抑制干擾操作簡(jiǎn)便。節(jié)約時(shí)間方法分類方法特點(diǎn)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第10頁(yè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法概念本方法是利用鱟試劑檢測(cè)由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否符合要求一個(gè)方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法包含凝膠法和光度測(cè)定法，因?yàn)槟z法操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高，而且藥典要求當(dāng)不一樣試驗(yàn)方法結(jié)果存在爭(zhēng)議時(shí)，除另有要求外，以凝膠法為準(zhǔn)，所以凝膠法被廣泛應(yīng)用。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第11頁(yè)鱟：一個(gè)古老棲身于沿海海洋生物，節(jié)肢動(dòng)物門，在我國(guó)主要分布于浙江、福建及兩廣沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到一個(gè)細(xì)胞溶解物，能與極微量細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)速度和凝膠堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度相關(guān)，是體外檢測(cè)內(nèi)毒素敏感試劑。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第12頁(yè)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第13頁(yè)凝膠法概念

凝膠法是經(jīng)過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素方法。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第14頁(yè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理內(nèi)毒素C因子活化C因子凝膠B因子凝固酶原凝固酶活化B因子凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)－酶聯(lián)反應(yīng)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第15頁(yè)二、細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法試驗(yàn)程序1、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計(jì)算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復(fù)核4、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法）5、供試品內(nèi)毒素限量檢驗(yàn)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第16頁(yè)凝膠法中用到儀器

1.超凈工作臺(tái)

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第17頁(yè)凝膠法中用到儀器2.恒溫培養(yǎng)箱

孵育樣品浸提液以及培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第18頁(yè)凝膠法中用到儀器3.干烤箱

用于試驗(yàn)用耐高溫器皿去熱源，溫度范圍要求最少300℃內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第19頁(yè)凝膠法中用到儀器4.移液器和無(wú)熱源移液尖（或者去熱源刻度吸管）

5.計(jì)時(shí)器、漩渦混合器、電子天平等內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第20頁(yè)凝膠法中用到器皿器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑10×75mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無(wú)熱原吸頭其它酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號(hào)筆內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第21頁(yè)凝膠法中用到試劑

1）鱟試劑：含有國(guó)家頒發(fā)同意文號(hào)2）細(xì)菌內(nèi)毒素工作品3）細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水（內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml無(wú)菌水）

4）75％乙醇內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第22頁(yè)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

當(dāng)使用新批號(hào)鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第23頁(yè)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

依據(jù)鱟試劑靈敏度標(biāo)示值（λ）,將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘,然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第24頁(yè)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

取復(fù)溶后0.1ml/支規(guī)格鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不一樣濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管各加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第25頁(yè)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果觀察

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，且不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；若不形成凝膠，或形成凝膠但倒轉(zhuǎn)180°后從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)防止受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第26頁(yè)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

若最大濃度2.0λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度測(cè)定值（λc），計(jì)算方法見(jiàn)中國(guó)藥典。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減內(nèi)毒素濃度中最終一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果濃度。當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ（包含0.5λ和2.0λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑靈敏度。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第27頁(yè)凝膠法試驗(yàn)步驟

下面我們結(jié)合中國(guó)藥典、GB14233.2醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法以及GB15810一次性無(wú)菌注射器來(lái)學(xué)習(xí)詳細(xì)試驗(yàn)方法。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第28頁(yè)試驗(yàn)步驟

浸提介質(zhì)（細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水）體積計(jì)算公告：V－－浸提介質(zhì)體積，單位為（ml）；L－－產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（該產(chǎn)品允許含有細(xì)菌內(nèi)毒素量），單位為EU/件；λ－－鱟試劑靈敏度標(biāo)示值，單位為EU/ml。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第29頁(yè)試驗(yàn)步驟樣品處理方法：

a）管類和容器類器具用細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水浸泡器具內(nèi)腔，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)；b）小型配件或?qū)嶓w類樣品置無(wú)熱源玻璃器皿內(nèi)，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水振蕩數(shù)次，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)。制備供試液儲(chǔ)存不應(yīng)該超出2h。普通要求供試液PH值在6.0~8.0之間，如不在該范圍內(nèi)，可用鱟試劑廠家提供PH緩沖液調(diào)整浸提液PH值。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第30頁(yè)試驗(yàn)步驟內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第31頁(yè)結(jié)果觀察

B、C溶液反應(yīng)管必須要陽(yáng)性，就是輕輕倒轉(zhuǎn)180度過(guò)來(lái)，鱟試劑安瓿里反應(yīng)溶液形成了凝膠體，不滑落。而D溶液，就是細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水那2管，必須要陰性，3個(gè)條件都滿足，就說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果是可信。最終看A溶液反應(yīng)情況：陽(yáng)性就說(shuō)明原套器具每件大于20EU，判定為不合格；陰性就說(shuō)明小于20EU,結(jié)果是合格；1管陽(yáng)性、1管陰性則要重新復(fù)查，復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若全部平行管均為陰性則判斷合格；不然判斷為不合格。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第32頁(yè)注意事項(xiàng)1.每批鱟試劑在用于試驗(yàn)前首先要進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)；2.安瓿開(kāi)啟前應(yīng)先用砂石劃痕(不論是色點(diǎn)或包環(huán)易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，千萬(wàn)不能用鑷子敲擊，預(yù)防碎玻屑掉入安瓿。3.在鱟試劑溶解、樣品稀釋及加入時(shí)，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確，緩緩加入防止氣泡。

4.保溫過(guò)程中不可隨時(shí)取出觀察，預(yù)防形成凝膠受到振動(dòng)后變形而誤判為陰性。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第33頁(yè)注意事項(xiàng)5.凍干鱟試劑應(yīng)存放在2-8℃下；防止長(zhǎng)時(shí)間放置在高于25℃溫度條件下。已復(fù)溶鱟試劑在間歇使用過(guò)程中最好放在2-8℃冰箱里，可存放24小時(shí)，在-20℃以下，可存放四個(gè)星期，鱟試劑只能凍融一次。

內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第34頁(yè)三、操作注意事項(xiàng)試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1、玻璃器具應(yīng)規(guī)范化，便于除熱原、計(jì)量準(zhǔn)確、清洗操作方便。洗凈去污去內(nèi)毒素去洗滌劑精洗除外源性熱原：250

℃干烤最少1小時(shí)。2、盡可能用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250

℃干烤最少1小時(shí)。3、用于內(nèi)毒素檢測(cè)稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且確保無(wú)內(nèi)毒素。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第35頁(yè)試驗(yàn)環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，確保環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。試驗(yàn)人員：用適宜洗滌劑洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。試驗(yàn)過(guò)程：1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)嚴(yán)格按要求低溫保留；工作標(biāo)準(zhǔn)品開(kāi)封后盡快使用且應(yīng)一次性用完，不再保留。2、溶解后標(biāo)準(zhǔn)品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；深入稀釋時(shí)每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s。內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第36頁(yè)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第37頁(yè)振蕩前振蕩后內(nèi)毒素分子在水溶液中狀態(tài)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法專家講座第38頁(yè)3、每一步稀釋液所用移液器不能重復(fù)、交叉使用。4、鱟試劑復(fù)溶時(shí)應(yīng)將檢驗(yàn)用水順著瓶壁加入，防止產(chǎn)生氣泡。5、操作時(shí)間長(zhǎng)短。環(huán)境溫度改變都會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，故