基因治療專業(yè)知識培訓專家講座

第十一章基因治療GeneTherapy基因治療專業(yè)知識培訓第1頁本章，我們討論4個問題。

1.概述

2.基因治療原理

3.基因治療中外源基因?qū)爰夹g(shù)

4.基因治療應(yīng)用研究

基因治療專業(yè)知識培訓第2頁

第一節(jié)概述基因治療專業(yè)知識培訓第3頁

人類疾病發(fā)生，往往包括到內(nèi)源基因突變（如遺傳病）和外源基因入侵（如感染性疾?。?。機體對外來侵襲抵抗表達在以下4個層次：

1.整體水平，諸如動物打斗撕咬；

2.細胞水平，如Mφ對“異已”吞噬作用；

3.分子水平，如抗原抗體反應(yīng)，人能夠產(chǎn)生106抗體分子，對付外來侵襲；

4.基因水平，對付外源基因入侵，在原核生物中有一個限制性核酸內(nèi)切酶可將外源基因水解掉?；蛑委煂I(yè)知識培訓第4頁

對于內(nèi)源基因突變:至今未找到令人滿意治療方法?；蛑委焹H僅處于初始階段。

全世界接收基因治療者106人，受試者600人基因治療專業(yè)知識培訓第5頁定義：

廣義地說，基因治療是應(yīng)用基因或基因產(chǎn)物，治療疾病一個方法。從狹義地說，基因治療是把外界正?；蚧蛑委熁颍?jīng)過載體轉(zhuǎn)移到人體靶細胞，進行基因修飾和表示，改進疾病一個治療伎倆。

一、基因治療概念基因治療是治療基因突變性疾病一項根本性辦法，同時它為非基因突變性疾病提供了一個新治療伎倆。基因治療專業(yè)知識培訓第6頁二、基因治療策略兩個基本策略:原位矯正病變基因基因取代或基因干預基因治療專業(yè)知識培訓第7頁

象外科移植手術(shù)，切除病變部分，換上正常健康基因，這在當前還難以做到(一)原位矯正病變基因(糾正異常堿基)圖11-1鐮形紅細胞貧血病人Hb為HbS(由β珠蛋白基因點突變引發(fā))基因治療專業(yè)知識培訓第8頁(二)基因取代或基因干預基因置換(genereplacement)經(jīng)過體內(nèi)基因同源重組,原位替換病變細胞內(nèi)致病基因基因增補(geneaugmentation)不除去異常基因，向靶細胞導入外源基因經(jīng)過非定點整合，使其表示產(chǎn)物，從而填補缺點基因功效基因干預(geneinterference)在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷一些基因異常表示。包含反義RNA、核酶、三鏈DNA及干擾RNA技術(shù)基因治療專業(yè)知識培訓第9頁

三、基因治療中靶細胞

生殖細胞:

優(yōu)點——治本困難——①生殖(學)生物學問題，極其復雜且不清楚。

②倫理學問題名人精子庫”，“美女卵子庫”，總是他人“種”，不好辦，即使這個問題處理，恐怕未必定，愛因斯坦生了個弱智女，馬克思后代在開出租車（不是說開出租車不好，特此申明）基因治療專業(yè)知識培訓第10頁體細胞——當前慣用體細胞有：①淋巴細胞②骨髓細胞③內(nèi)皮細胞④皮膚纖維細胞⑤肝細胞⑥肌細胞⑦角化細胞(keratinoyte)⑧各種腫瘤細胞附:選擇靶細胞依據(jù)①疾病累及主要部位。②靶細胞起源難易程度。③體外培養(yǎng)成活率和存活時間。④接收正常基因能力。⑤新正常基因能否在靶細胞能否正常表示和連續(xù)時間。基因治療專業(yè)知識培訓第11頁

四、基因治療路徑

1.間接體內(nèi)療法（exvivo）體外將治療基因→靶細胞內(nèi),再將經(jīng)基因修飾靶細胞→病人,使這種外源基因(細胞)在體內(nèi)表示，從而到達基因治療目標.(當前多采取這種療法)。2.體內(nèi)法(invivo)外源基因→直接導入體內(nèi)相關(guān)組織器官→進入對應(yīng)組織器官進行表示→從而到達基因治療目標?；蛑委煂I(yè)知識培訓第12頁

基因治療基本原理第二節(jié)基因治療專業(yè)知識培訓第13頁基因治療基本程序(基本原理或基本步驟)：治療性基因選擇基因載體選擇

病毒載體非病毒載體靶細胞選擇

體細胞生殖細胞載體與治療基因重組及篩選判定將重組DNA導入靶細胞,檢測目標基因和標識基因表示產(chǎn)物基因治療專業(yè)知識培訓第14頁基因治療基本程序(基本原理或基本步驟)：基因轉(zhuǎn)移

間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法轉(zhuǎn)導細胞篩選與判定回輸體內(nèi)利用標識基因和目標基因表示產(chǎn)物利用核酸分子雜交考評療效和安全性基因治療專業(yè)知識培訓第15頁

基因工程基因治療1.目標基因應(yīng)用或研究基因標志基因+治療基因2.載體(原核或真核)(真核)3.靶細胞原、真核真核4.DNA體外重組√√5.重組DNA導入宿主細胞√√6.后處理√√基因治療與基因工程比較基因治療專業(yè)知識培訓第16頁

第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)基因治療專業(yè)知識培訓第17頁

生物學方法非生物學方法①逆轉(zhuǎn)錄病毒載體①磷酸鈣共沉淀法②腺病毒載體②質(zhì)粒DNA/脂質(zhì)體法③腺相關(guān)病毒載體③電擊法④單純皰疹病毒載體④受體介導轉(zhuǎn)移法⑤注射法以逆轉(zhuǎn)錄病毒法最為慣用，以磷酸鈣法最為廉價（經(jīng)濟），以注射法最為簡捷，最值得研究和推廣應(yīng)用（笑話，也最危險。）轉(zhuǎn)移基因方法基因治療專業(yè)知識培訓第18頁基因治療專業(yè)知識培訓第19頁

一.病毒載體——轉(zhuǎn)基因生物學方法（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒生活（命）周期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)(三)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功效特點

(四)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)（五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備（六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（七）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移安全性問題基因治療專業(yè)知識培訓第20頁

1.吸附——病毒衣殼糖蛋白與細胞膜受體特異性結(jié)合，吸附在膜受體上。

2.入胞——病毒核酸進入host細胞，逆轉(zhuǎn)錄，整合到hostDNA中去，轉(zhuǎn)錄、復制

3.病毒顆粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白裝配成成熟病毒顆粒

4.病毒顆粒釋放——釋放子病毒又可感染其它細胞，每個細胞能夠釋放105子病毒。（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒生活（命）周期基因治療專業(yè)知識培訓第21頁

圖11-2Rous肉瘤病毒毒粒結(jié)構(gòu)示意圖基因治療專業(yè)知識培訓第22頁1.普通特征(1)正鏈RNA病毒即與mRNA極性相同（5‘→3’），反之為(一)；(2)5‘有m7Gppp帽，3‘有poly（A）尾；(3)病毒進入細胞后，經(jīng)本身逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA分子→細胞核并整合到宿主染色體,這種整合病毒DNA稱為前病毒(provirus)(不論是源于RNA還是DNA)(并非全部逆轉(zhuǎn)錄病毒都致癌)。（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)基因治療專業(yè)知識培訓第23頁

圖11-3逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組基本結(jié)構(gòu)2．基因組結(jié)構(gòu)基因治療專業(yè)知識培訓第24頁

(三)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功效特點

保留病毒LTR,ψ,去除病毒結(jié)構(gòu)基因,加上一個抗性標識基因LTRLTRψNeoAmproriE基因治療專業(yè)知識培訓第25頁

(四)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)保留病毒LTR,ψ,用目標基因和抗性標識基因置換了病毒結(jié)構(gòu)基因LTRLTRψNeoAmproriETargetgene基因治療專業(yè)知識培訓第26頁

慣用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖

基因治療專業(yè)知識培訓第27頁

（五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備是將缺失了包裝信號及相關(guān)序列缺點型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助病毒）導入哺乳細胞內(nèi)而制備成一個特殊細胞系，這種細胞因攜帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組而大量產(chǎn)生病毒包裝蛋白，而輔助病毒本身缺乏包裝信號（ψ序列）而不能包裝,不產(chǎn)生病毒顆粒。1．包裝細胞(1)包裝細胞定義基因治療專業(yè)知識培訓第28頁

①為了取得感染能力,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不含病毒結(jié)構(gòu)基因,不能產(chǎn)生gag、pol、env

②野生型MO-MLV可供這些蛋白質(zhì)，為何不用野生型MO-MLV？包裝后會產(chǎn)生大量有復制能力野生型病毒顆粒，進入體內(nèi)可能大量復制，含有插入突變危險，尤其是插入激活癌基因，滅活抑癌基因危險，不利于治療用。

所以要設(shè)計一個細胞——重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能在其中包裝成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒（確切說，只有一次感染能力），但能從中釋放出來到靶細胞，這就是包裝細胞，不產(chǎn)生復制能力野生型包裝結(jié)構(gòu)。(2)為何要包裝細胞？基因治療專業(yè)知識培訓第29頁

(3)三代包裝細胞第一代包裝細胞ψ2細胞系:這種細胞基因組中整合有僅僅缺失包裝信號MLV前病毒基因組。只要與載體（含）之間有一次重組，就能夠產(chǎn)生有復制能力野生型病毒。

第2代包裝細胞

PA317細胞系:含逆轉(zhuǎn)錄病毒PAM3基因組，缺失Ψ信號及部分5LTR，3LTR被SV40多聚A化信號取代,與載體最少要經(jīng)過2次獨立重組才能形成有復制能力野生型病毒

第3代包裝細胞

ΨCRIP:含2種逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組,每種不但缺失Ψ信號,且僅含病毒部分結(jié)構(gòu)基因,經(jīng)過屢次獨立重組，才能產(chǎn)生有復制能力野生型病毒基因治療專業(yè)知識培訓第30頁2．重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備

Ψ-

LTRLTRψNeoLTRLTRψNeoTargetgeneLTRLTRgag

pol

env形成假病毒,出芽釋放到細胞外逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進包裝細胞,整合后轉(zhuǎn)錄成RNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA被病毒蛋白包裝包裝細胞已整合有缺失ψ逆轉(zhuǎn)錄病毒基因,可產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因治療專業(yè)知識培訓第31頁

（六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)1．逆轉(zhuǎn)錄病毒介導基因轉(zhuǎn)移靶組織細胞

靶細胞最基本要求:

細胞表面含有逆轉(zhuǎn)錄病毒對應(yīng)受體

最慣用作基因治療靶有：

骨髓干細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、肝細胞、血管內(nèi)皮細胞和肌細胞，還包含全部腫瘤細胞基因治療專業(yè)知識培訓第32頁

2．基因轉(zhuǎn)移方法與路徑exvivo分離培養(yǎng)宿主細胞,離體轉(zhuǎn)移基因,效率高，但大多人體組織細胞原代培養(yǎng)比較困難。

invivo重組逆轉(zhuǎn)病毒載體直接注射路徑主要有：①采取靜脈注射路徑②直接將產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝細胞注射到組織或腫瘤中③直接將表示載體，基因治療專業(yè)知識培訓第33頁

3．重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向基因轉(zhuǎn)移

①重組逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒整合位點靶向性

大多數(shù)前病毒整合作用是隨機，對DNaseI超敏區(qū)域和轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域整合是含有優(yōu)先整合傾向性。在腫瘤中前病毒優(yōu)先與細胞原癌基因和染色體脆性位點整合。

②經(jīng)過基因轉(zhuǎn)移方法與路徑限制受感染細胞exvivo:被感染靶細胞被預先選擇，細胞靶向性能夠很好地實現(xiàn)invivo:將重組病毒注射到特定組織器官或其腔體內(nèi)，以到達很好組織細胞選擇性基因轉(zhuǎn)移目標，如進行腫瘤實體內(nèi)注射，使重組病毒主要感染腫瘤細胞?；蛑委煂I(yè)知識培訓第34頁

③病毒感染水平限制

利用逆轉(zhuǎn)錄病毒對人類細胞一些亞群含有限制性親嗜性。如HIV和HTLV-1④基因轉(zhuǎn)錄水平限制

在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中導入含有基因表示調(diào)整作用序列利用α-甲胎蛋白基因肝組織特定性調(diào)整成份與TK基因相連基因治療專業(yè)知識培訓第35頁5‘LTRψNeoAmproriE3‘LTR插入外源cDNA5‘LTRψNeoAmproriE3‘LTRcDNAψSLTRSLTR轉(zhuǎn)錄gpemRNAψmRNA病毒蛋白質(zhì)包裝完成假病毒顆包裝，分泌到包裝細胞培養(yǎng)上清液中。逆轉(zhuǎn)錄感染靶細胞前病毒前病毒插入外源基因轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)G418篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染靶細胞基本過程轉(zhuǎn)染包裝細胞，轉(zhuǎn)錄出RNA基因治療專業(yè)知識培訓第36頁

（七）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移安全性問題1．產(chǎn)生野生型病毒

存在有復制能力野生型病毒，主要起源于載體ψ和不含ψ序列輔助病毒重組成野生型病毒2．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入破壞性

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶基因在受體細胞染色體上基因組合是隨機。與臨近基因相互作用,可能激活癌基因，滅活抑癌基因或破壞細胞生長必需基因。3．污染問題

基因治療專業(yè)知識培訓第37頁

因為病毒感染性和寄生特征，使現(xiàn)在約85%基因治療臨床項目采取病毒載體。不過病毒載體存在免疫原性高、毒性大、目標基因容量小，靶向特異性差，制備復雜及費用較高等不足。所以人們愈來愈重視非病毒法研究。 非病毒載體本質(zhì)是將基因治療中基因看作為藥品，然后從藥劑和藥理學角度怎樣把基因?qū)氚屑毎蚪M織、器官并進行表示?；蜃鳛樗幤钒l(fā)揮治療作用關(guān)鍵問題是導入靶向性，表示有效性和可調(diào)控性。二.非病毒載體轉(zhuǎn)基因非生物學方法基因治療專業(yè)知識培訓第38頁非病毒載體優(yōu)缺點優(yōu)點缺點1.不需包裝細胞，制備易、省時、滴度也不受限制，而且可對質(zhì)粒或其它形式核酸進行快速分析；2.對基因大小或核酸類型不限；3.免疫原性低，急性毒性小，對受試者比較安全；4.可含有特異靶向性，并能轉(zhuǎn)移至非分裂期細胞并有效表示；5.制備方便且重復性好，含有完全人工合成和大規(guī)模生產(chǎn)可行性，所以較簡單和廉價。1.轉(zhuǎn)移效率較病毒載體低。2.基因表示連續(xù)時間短；3.許多問題仍需求援病毒或病毒成份處理?；蛑委煂I(yè)知識培訓第39頁1.方法用一定百分比磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸→共溶于氯仿→制備成雙層磷脂封閉囊泡→超聲波處理→將待轉(zhuǎn)移外源基因DNA包入→制備成脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA復合物→利用其能與細胞膜融合特征，可將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細胞中。2.優(yōu)點脂質(zhì)體作為載體能夠攜帶各種DNA片段，且在轉(zhuǎn)移途中保護基因不被核酸酶降解。3.缺點轉(zhuǎn)移效率低、制備麻煩、商品較貴。

（一）脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)移方法基因治療專業(yè)知識培訓第40頁

1．陽離子脂質(zhì)體

由帶正電荷脂類如四胺基去污劑、膽固醇陽離子衍生物、二?；视秃投喟分愌苌锖椭行暂o助脂類如二油?；字Ｒ掖及罚―OPE）或二油?；字Ｄ憠A（DOPC）等摩爾混合組成。經(jīng)過電荷相互作用，陽性電荷脂質(zhì)體和帶陰電荷DNA之間能夠有效地形成復合物。因為含有多出正電荷，復合體能夠與細胞膜帶負電荷唾液酸結(jié)合，然后經(jīng)過內(nèi)吞作用攝取載體復合體。基因治療專業(yè)知識培訓第41頁

2．陰離子（anionic）脂質(zhì)體

含有磷脂酰絲氨酸或含50%二棕櫚磷脂酰甘油,因為磷脂和寡聚核苷酸均帶負電荷，必須在脂質(zhì)體中加入鈣離子方可提升包裝效率。由陰離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運寡聚核苷酸首先定位細胞核，也延長了寡聚核苷酸在細胞內(nèi)保留時間。陰離子脂類能夠置換陽離子脂質(zhì)/DNA復合體DNA

基因治療專業(yè)知識培訓第42頁

3．pH敏感型脂質(zhì)體

可由二油酰膽堿（DOPE）、膽固醇和油酸以4：4：2（摩爾比）組成

DOPE決定了脂質(zhì)體在中性pH條件下穩(wěn)定性和酸性條件下與細胞融合能力

酸性條件下可造成其脂肪酸羧基質(zhì)子化而引發(fā)六角晶相形成造成膜融合發(fā)生基因治療專業(yè)知識培訓第43頁

（二）受體介導基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

1.方法利用細胞表面各種特定受體配基為“導彈頭”與多價陽離子聚合物（或能與其它能強烈吸附DNA物質(zhì)相連接），組成導向性運輸載體，經(jīng)過細胞內(nèi)吞作用，將目標基因靶向性地移至某種特定細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法。2.特點：受體介導內(nèi)吞作用含有：1）細胞組織器官特異性；2）轉(zhuǎn)移效率高。3.舉例：此法研究較多是唾液酸糖蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白。如：利用唾液酸糖蛋白（配體）攜帶表示載體已成功地將目標基因轉(zhuǎn)移至肝細胞內(nèi)，取得目標基因表示?；蛑委煂I(yè)知識培訓第44頁

（三）注射法1．直接注射

將裸露DNA直接注入肌肉內(nèi)，外源基因在肌肉中表示量與注入外源性基因含量成正比，與溶液體積無關(guān)。2．顯微注射法采取尤其顯微注射器在顯微鏡下把重組DNA導入靶細胞顯微注射法:在顯微鏡下將注射器針頭穿過細胞膜后刺入細胞核，將重組DNA直接注入受體細胞核中穿刺法:在顯微鏡下用顯微注射針穿刺細胞膜及核膜，將重組DNA加入細胞培養(yǎng)液中，使細胞周圍重組DNA有機會進入細胞中

基因治療專業(yè)知識培訓第45頁

（四）電泳沖介導法（電穿孔法）是對受體細胞加入高壓電脈沖，使細胞上形成許多瞬間小孔，從而使不一樣細胞之間原生質(zhì)發(fā)生融合，或使外源DNA經(jīng)過細胞膜上出現(xiàn)瞬間小孔而進入細胞。（五）超聲介導轉(zhuǎn)染方法（六）微粒轟擊法(七)磷酸鈣共沉淀法基因治療專業(yè)知識培訓第46頁

三、非病毒載體優(yōu)化策略

（一）靶向性問題

利用細胞表面特異性表示受體或蛋白來處理靶向性（targeting）問題

比如:唾液酸糖蛋白（asialo-glycoprotein，ASGP）能與肝細胞上去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合并介導內(nèi)吞特點，將ASGP與攜帶DNA多聚陽離子多肽共價結(jié)合，證實DNA主要進入肝細胞并能高效表示

靶向性配體主要有單克隆抗體、病毒胞膜蛋白、生長因子或激素等

配體和DNA連接物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、精蛋白和陽離子脂質(zhì)體，DNA嵌合劑、DNA抗體等基因治療專業(yè)知識培訓第47頁

（二）內(nèi)吞小泡釋放（endosomereleasing）問題促進DNA從內(nèi)吞小泡釋放策略：①利用抑制溶酶體藥品、融合型脂類、pH敏感脂質(zhì)體或有側(cè)鏈多聚陽離子和星狀樹突體等來破壞內(nèi)吞小泡膜以釋放其中DNA；②經(jīng)過耦聯(lián)技術(shù)，利用病毒或病毒蛋白、細菌蛋白、短肽等。

基因治療專業(yè)知識培訓第48頁

（三）轉(zhuǎn)運入核問題

SV40大T抗原PKKKRKV序列、VP1、肽核酸和聚乙烯亞胺（PEI）能夠促進DNA核轉(zhuǎn)運。（四）基因及其表示調(diào)控問題經(jīng)過優(yōu)化開啟子、增強子、內(nèi)含子、終止序列及密碼子使用來提升載體質(zhì)粒上靶基因表示和安全性。入核問題也可屬于此范圍。基因治療專業(yè)知識培訓第49頁

第四節(jié)反義RNA、核酶和三鏈DNA在基因治療中應(yīng)用基因治療專業(yè)知識培訓第50頁

核酸包含DNA和RNA，都是遺傳物質(zhì)，所以反義核酸可稱作反義基因，即能經(jīng)過互補堿基與DNA或mRNA互補核酸分子。反義RNA技術(shù)、核酶技術(shù)、三鏈DNA技術(shù)，廣義地說，這3者能夠統(tǒng)稱為反義核酸技術(shù)，3者之間有一定聯(lián)絡(luò)，也有一定區(qū)分。一.反義核酸概念基因治療專業(yè)知識培訓第51頁1.反義RNA（antisenseRNA）:與mRNA互補RNA。結(jié)合時，可阻止mRNA翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。2.核酶（ribozyme）：含有催化功效RNA稱為核酶。其與對應(yīng)mRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性，將mRNA降解。3.三鏈DNA(反義基因)：是人工合成寡核苷酸（oligodexynucleotide,olgoDT），其進入機體，以胞吞方式進入細胞，可直接結(jié)合到DNA雙鏈特定部位，形成三聚體，影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄過程不能開啟。二.反義核酸用于基因治療基本原理基因治療專業(yè)知識培訓第52頁1）抗腫瘤：就是應(yīng)用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷一些異常基因表示，以期阻斷瘤細胞內(nèi)異常信號傳導，使瘤細胞進入正常分化軌道或引發(fā)細胞凋亡。2）抗病毒：用反義DNA或反義RNA阻斷DNA復制，轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而到達抗病毒目標。反義核酸在基因治療中應(yīng)用基因治療專業(yè)知識培訓第53頁反義RNA應(yīng)用方法有兩種

1）體外合成反義RNA直接作用細胞，細胞吸收后發(fā)揮作用；2）構(gòu)建表示質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入細胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA發(fā)揮作用。

三.反義核酸技術(shù)（一）反義RNA技術(shù)意義:抑制一些有害基因表示或失控基因過分表示

基因治療專業(yè)知識培訓第54頁

處理首要問題:1．專一性轉(zhuǎn)移問題進行基因治療時，反義RNA必須專一性轉(zhuǎn)移到病變細胞中2．反義RNA進入靶細胞前降解問題

反義RNA抗RNase能力不強

受體介導反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)是處理上述兩個問題一條十分有希望路徑。基因治療專業(yè)知識培訓第55頁

受體介導反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)針對上述2個問題人們設(shè)計一個反義RNA運載工具，如：①ASGP-PL（脫唾液酸血清類粘蛋白一多聚賴氨酸)，能將反義RNA運至肝細胞發(fā)揮作用；②利用受體介導反義RNA在抑制c-myc和乙肝病毒基因表示方面有所研究，基本上克服了上述弱點?；蛑委煂I(yè)知識培訓第56頁1）安全性高：反義RNA只針對特異mRNA分子，不改變所調(diào)整基因結(jié)構(gòu)，而且最終在細胞內(nèi)降解，不留“殘渣”。2）設(shè)計制備方便：設(shè)計復蓋5‘端反義RNA能夠封帽反應(yīng)（mRNA不能進入核糖體），即可抑制特定基因表示和功效。制備也較簡單：①體外轉(zhuǎn)錄得到，②利用表示載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到3）含有劑量調(diào)整效應(yīng)；4）能直接作用一些RNA病毒；5）發(fā)展：設(shè)計“抗降解”RNA，能夠延長反義RNA壽命；設(shè)計“反義RNA+核酶”復合功效體、現(xiàn)有“封閉”又有“切割”作用。3.應(yīng)用前景：基因治療專業(yè)知識培訓第57頁1.核酶設(shè)計應(yīng)考慮原因核酶由“兩端引導序列+中間保守序列”組成，①引導序列取決于靶序列堿基組成,②中間保守序列：是酶活性結(jié)構(gòu)域,酶活性中心包含結(jié)合部位和催化中心，

（二）核酶（ribozyme）技術(shù)核酶兩端引導序列與靶RNA分子序列互補，起著識別和結(jié)合底物作用。

設(shè)計基本標準是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域

基因治療專業(yè)知識培訓第58頁人工設(shè)計核酶粗線表示合成核酸分子細線表示天然核酸分子X表示一致性序列箭頭表示切斷點基因治療專業(yè)知識培訓第59頁

①化學合成：提供序列次序，由廠家合成、很方便。②體外轉(zhuǎn)錄:a據(jù)靶序列先合成DNA雙鏈；b將dsDNA克隆到表示載體上；c利用表示載體轉(zhuǎn)錄取得核酶。2.核酶制備：基因治療專業(yè)知識培訓第60頁外源導入：借助脂質(zhì)體包裹導入細胞內(nèi)。內(nèi)源導入：借助逆轉(zhuǎn)錄病毒表示載體轉(zhuǎn)染。導入細胞同時，分別導入?yún)R報基因與反義表示載體（帶匯報基因）作對照，用以檢測載體表示能力，以區(qū)分抑制作用是核酶還是反義RNA。3.核酶導入細胞兩種方法基因治療專業(yè)知識培訓第61頁1.意義:（三）反義基因(三鏈DNA)技術(shù)經(jīng)過形成三鏈DNA,完全抑制特定基因表示。三鏈DNA被稱為“能夠攻擊病毒和癌細胞而不損害健康組織”新型基因藥品。

2.作用機制:合成同聚嘌呤或同聚嘧啶脫氧寡核苷酸（ODN）在一定條件下也能夠與雙螺旋DNA分子中同聚嘌呤·同聚嘧啶區(qū)段結(jié)合形成局部分子間三鏈DNA,可干擾核蛋白因子或聚合酶與DNA這一位點結(jié)合，所以三鏈DNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表示?；蛑委煂I(yè)知識培訓第62頁

3、技術(shù)關(guān)鍵:①專一性：針對靶序列設(shè)計高度選擇性反義基因；②穩(wěn)定性：經(jīng)過化學修飾，使反義基因能抵抗體內(nèi)核酸酶進攻，延長反義基因壽命。③攝取及分布:直接經(jīng)過擴散作用進入細胞內(nèi)，同時還經(jīng)過細胞內(nèi)吞作用入胞。ODN攝取過程是一個依賴于堿基序列長度、活性及飽和內(nèi)循環(huán)過程。基因治療專業(yè)知識培訓第63頁

第五節(jié)基因治療應(yīng)用研究

基因治療專業(yè)知識培訓第64頁

除外傷性疾病外，全部疾病都是遺傳原因（內(nèi)因）與環(huán)境原因（外因）相互作用結(jié)果。①遺傳原因起主要作用疾病如：血友病、白化病、苯酮尿癥等；②環(huán)境原因起主要作用疾病如：傳染病、營養(yǎng)性疾病等；③二者都起主要作用疾病如：糖尿病、高血壓、冠心病、腫瘤、精神分裂癥等。當前發(fā)覺：單基因病4000各種，多基因病不少于1000種，染色體病100各種，伴隨傳染病與營養(yǎng)性疾病有效控制和科技經(jīng)濟文化深入發(fā)展，遺傳病患病率有相對上升趨勢。基因治療專業(yè)知識培訓第65頁（一）3個考慮原因和3個困難：1.3個考慮原因：1）對該病相關(guān)基因應(yīng)詳盡了解，能在試驗中克隆該基因，并能導入真核細胞中表示；

2）只需產(chǎn)生較少許原來缺點基因表示產(chǎn)物就能矯正疾?。?）即使導入基因過渡表示，對機體也無不良反應(yīng)。一.遺傳病基因治療基因治療專業(yè)知識培訓第66頁2.3個困難：1）導入外源基因調(diào)控問題導入外源基因（治療基因）接收體內(nèi)調(diào)控系統(tǒng)統(tǒng)一調(diào)控，這在當前難以做到，有待深入研究。2）有些遺傳病是一些特殊細胞損傷造成，這些細胞不易取出供體外基因工程操作用3）單基因遺傳病，缺點只局限于某一個發(fā)病基因，但其造成臨床結(jié)果往往廣泛累及多個臟器當前只有幾個體細胞適用體外基因治療基因治療專業(yè)知識培訓第67頁1.腺苷脫氨酶（adenosinedeaminse,ADA）催化反應(yīng)腺嘌呤脫氧核苷次黃嘌呤苷→次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸(醇式)(人和猿終產(chǎn)物)2.ADA缺點生化代謝障礙及其臨床癥狀ADA缺點↓→腺嘌呤核苷酸代謝受阻→dATP↑→T淋巴細胞DNA鏈不停崩解，同時激活DNA依賴ADP-核糖聚合酶活性,降低NAD水平，使蛋白質(zhì)合成降低細胞死亡，同時也影響B(tài)細胞功效。ADA缺點常伴有重癥聯(lián)合免疫缺點（SCID）癥狀。ADA（二）腺苷脫氨酶（ADA）缺點遺傳病基因治療基因治療專業(yè)知識培訓第68頁

1）單個核細胞分離：使用淋巴細胞分層液分離患兒血中單個核細胞；2）單個核細胞培養(yǎng)：以“OKT3抗體+IL2”刺激體外培養(yǎng)T細胞增殖，分化；3）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導外源基因轉(zhuǎn)染T細胞；4）將轉(zhuǎn)染細胞回輸給患兒體內(nèi)。

3.ADA基因治療方案：ADA缺點基因治療始于1990年9月14日，治療對象是1個4歲美國女孩，方案是：基因治療專業(yè)知識培訓第69頁ADA缺點基因治療取得了成功，但每間隔3～5個月，一樣基因治療操作程序必須一樣重新進行。治療麻煩給病人也增加了痛苦，這是因為淋巴細胞壽命只有幾個月時間。研究者正在考慮是否使用壽命較長靶細胞，當然以骨髓干細胞轉(zhuǎn)導和回輸為好，人們在不停努力。4.問題基因治療專業(yè)知識培訓第70頁二.腫瘤基因治療基因治療專業(yè)知識培訓第71頁1.抑制和殺傷腫瘤細胞1）恢復抑癌基因功效轉(zhuǎn)染正常抑癌基因于腫瘤細胞，使之表示正常抑癌基因產(chǎn)物，在一定程度上抑制腫瘤惡性表型，如轉(zhuǎn)染P53和RB。2）抑制癌基因表示①使用抑癌基因關(guān)閉癌基因表示或使其表示產(chǎn)物失活；②使用反義核酸抑制癌基因轉(zhuǎn)錄

（一）腫瘤基因治療策略基因治療專業(yè)知識培訓第72頁依據(jù):HSV-tk基因編碼胸腺嘧啶激酶可將開環(huán)鳥苷衍生物GCV（Gancilevir）轉(zhuǎn)變成有毒性代謝產(chǎn)物，后者能殺死正在分裂（腫瘤）細胞。方案:用“HSV-tk基因”重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染tk基因。特點:①插入HSV-tk基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能整合至惡性腫瘤細胞染色體,對正常細胞不整合;②GCV只能殺死表示HSV-tk激酶腦瘤細胞,不殺死正常細胞,因為哺乳動物內(nèi)源tk激酶對GCV不敏感；③腦組織對異體細胞排斥能力低，異體細胞在其中能夠存活較長時間，3）自殺療法基因治療專業(yè)知識培訓第73頁2.腫瘤細胞基因修飾外源基因?qū)肟稍鰪娔[瘤細胞免疫原性1）導入細胞因子基因（如IL-2，IL-1等）

導入腫瘤細胞，以刺激機體產(chǎn)生較強免疫應(yīng)答，引發(fā)抗瘤效應(yīng)。2）導入MHC基因和共刺激分子基因腫瘤細胞可經(jīng)過MHC和共刺激分子表示減弱或缺失逃逸免疫攻擊，誘導表示或者直接轉(zhuǎn)染MHC基因和共刺激分子基因可能提升腫瘤免疫原性基因治療專業(yè)知識培訓第74頁1）細胞因子基因?qū)朊庖呒毎?/p>

Rosenberg教授以細胞因子（如TNF、IL2）基因轉(zhuǎn)導TIL細胞治療晚期惡性黑色素瘤病人。依據(jù):1）TIL對腫瘤細胞有殺傷作用。2）TIL細胞在體外殺傷腫瘤細胞效率較LAK強50～100倍。3.調(diào)整和增強機體免疫功效基因治療專業(yè)知識培訓第75頁2）基因修飾樹突狀細胞

用腫瘤抗原基因聯(lián)合腫瘤抗原肽修飾樹突狀細胞效果更加好。3）分泌免疫毒素T淋巴細胞

將免疫毒素基因?qū)隩淋巴細胞，使其表示和分泌免疫毒素，殺傷腫瘤細胞，殺傷作用不受MHC限制。4）腫瘤DNA疫苗將腫瘤抗原基因克隆到真核表示載體，采取肌肉注射方法導入體內(nèi)3.調(diào)整和增強機體免疫功效基因治療專業(yè)知識培訓第76頁

一些嚴重危害人類健康病毒性感染，如病毒性肝炎，AIDS病，I型T淋巴細胞病毒感染引發(fā)T淋巴瘤，可采取特異反義RNA或反義DNA來封閉病毒結(jié)構(gòu)蛋白mRNA，以特異抑制或阻止病毒表示。HIV是一個逆轉(zhuǎn)錄病毒，和靶細胞膜上CD4分子（受體）結(jié)合后進入細胞。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后整合到宿主染色體。在HIV生命周期中，HIV基因組復制、轉(zhuǎn)錄、表示是能夠調(diào)整、利用反義RNA核酸技術(shù)用以破壞HIV表示調(diào)控以到達基因治療目標。三、感染性疾病基因治療基因治療專業(yè)知識培訓第77頁HIV基因及其功效基因（以前名稱）功能結(jié)構(gòu)基因gag關(guān)鍵蛋白（P17、P24、P9、P7）Pol酶（逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶）env外膜蛋白（gp120gp41）調(diào)整基因Tat（tat-3,ta）正調(diào)整Rev（art,trs）分化調(diào)整Nef（3‘orf,BE‘F）負調(diào)整Vif（sor,A,p’,Q）感染因子Vpr(R)不清楚Vpll不清楚基因治療專業(yè)知識培訓第78頁調(diào)整基因中以tat（正調(diào)整），rev