動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白的工藝選擇

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白的工藝選擇3米力陳志南33（第四軍醫(yī)大學細胞工程中心國家863西安細胞工程基地西安710032摘要目前全世界蛋白治療藥物的迅速增長和市場需求已遠遠超過了現(xiàn)有生產(chǎn)能力。動物細胞規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝選擇可考慮使用當前較成熟的工業(yè)化支持技術(shù)平臺，以縮短產(chǎn)品工藝研發(fā)的時間，加快工業(yè)化進程。當前被FDA批準的生物技術(shù)產(chǎn)品以及公開發(fā)表的生產(chǎn)工藝占有主流優(yōu)勢的是攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng),工藝設(shè)計是流加或灌流培養(yǎng)。其大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)所面臨的挑戰(zhàn)是獲得最大生產(chǎn)力的同時注重維持產(chǎn)品的質(zhì)量;去除所有培養(yǎng)環(huán)境中外源因子的污染，更為精確有效的工藝控制手段，規(guī)模化培養(yǎng)中氧氣的限定與溶解CO2濃度累積的控制等。關(guān)鍵詞動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白收稿日期:20032042103國家重大科技專項（2002AA2Z344133通訊作者，電子信箱:chcerc2@動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)已成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一,并以其研究的深入和進展推動生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。專家預言:蛋白治療藥物如糖蛋白，抗體和多肽藥物僅僅只是開始進入市場,預計在下一個10年或20年會有一個更為快速的發(fā)展。蛋白治療藥物的迅速增長和市場需求已遠遠超過目前全世界的生產(chǎn)能力[1]由于動物細胞表達產(chǎn)品需求的緊迫性和生產(chǎn)工藝的復雜性，大大促進了該技術(shù)的深入研究與發(fā)展。80年代初首先興起了生物反應器研究，許多形式的生物反應器被用于哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝的研究，如中置攪拌系統(tǒng),固定單層培養(yǎng)和中空纖維系統(tǒng)等。近10年的研究在解決動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵屏障技術(shù)，如限制性氧氣的提供，消耗產(chǎn)物的積累,成熟精確的過程控制，剪切力的敏感性，和貼壁細胞培養(yǎng)規(guī)?；糯蟮葐栴}都取得可喜的進展[2]。目前動物細胞工業(yè)化生產(chǎn)中主要致力于提高單位細胞的生產(chǎn)力，確保產(chǎn)品質(zhì)量和過程工藝設(shè)計的一致性，減少工業(yè)化生產(chǎn)中的污染與自動化控制等[3]。以轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物為載體的重組蛋白生產(chǎn)在生物制藥領(lǐng)域仍具有重要的地位,特別對于每年100kg的超大規(guī)模需求量生產(chǎn)。目前被美國FDA批準的生物技術(shù)產(chǎn)品和已公開發(fā)表的生產(chǎn)工藝,都是較為成熟的工藝，并不代表當前動物細胞研究發(fā)展的趨勢。因此動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白或抗體的工藝選擇，應綜合考慮產(chǎn)品特點、工藝難度與工藝研發(fā)時間，以加速其產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的進程。以下就目前動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)成熟工藝與當前研究的問題、對策作一簡述。1目前美國FDA批準的產(chǎn)品與生產(chǎn)工藝1996年1月至2002年12月美國獲得成功批準的不同的治療劑和診斷劑產(chǎn)品共31種，其中用哺乳動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的就有21種（美國FDA網(wǎng)頁http:nnwww.fda.g蛋■白治療藥物有單克隆抗體治療乳腺癌的Herceptin，免疫球蛋白腫瘤壞死因子（TNF受體融合蛋白治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的Enbrel和滅活的甲肝疫苗Vaqta等。動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為一個受到普遍信任的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù),并逐步形成商業(yè)化操作水平。按技術(shù)應用專利的分類，我們將這些產(chǎn)品分為重組治療藥物、疫苗、組織培養(yǎng)產(chǎn)品和診斷試劑并連同他們的生產(chǎn)形式列于表1。總結(jié)表1的數(shù)據(jù)，在21種產(chǎn)品中有11種產(chǎn)品是用3種主要的細胞系CHO、SP2n0、NSO生產(chǎn)的重組蛋白治療藥物。首先重組治療藥物，主要是重組蛋白或抗體，對產(chǎn)品應用最有代表性的需要是生產(chǎn)第23卷第7期中國生物工程雜志CHINABIOTECHNOLOGY2003年7月表1BLA哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來源產(chǎn)品詳細數(shù)據(jù)a(1996?2000BLA產(chǎn)品名廠商批準日期產(chǎn)品形式細胞系方法培養(yǎng)液重組蛋白TenecteplasenTNKase急性心肌梗死Genentech6n2n00重組糖蛋白CHO無報道無報道抗血友病因子GeneticsInstitute3n6n00重組糖蛋白CHO連續(xù)灌流無血清TrastuzumabnHerceptin轉(zhuǎn)移性乳腺癌Genentech9n25n98嵌合抗體CHO攪拌生物反應器，懸浮無血清InfliximabnRemicadeCrohn’sdiseaseCentocor8n24n98嵌合抗體NS0攪拌,懸浮灌流培養(yǎng)無血清PalivizumabnSynagis預防呼吸道病毒MedImmune6n19H98嵌合抗體NS0攪拌,懸浮流加培養(yǎng)無血清BasiliximabnSimulect預防急性器官排斥NovartisPharmaceuticals5ni2n98嵌合抗體鼠骨髓瘤攪拌,懸浮灌流培養(yǎng)無血清DaclizumabnZenapax預防急性器官排斥Hoffman2LaRoche12ni0H97嵌合抗體SP2n0無報道無報道RituximabnRituxan淋巴瘤IDECPharmaceuticalnGenentech11H26H97嵌合抗體CHO攪拌,懸浮培養(yǎng)含慶大酶素Coagulationfactor]X重組凝集因子GeneticsInstitute2H11n97重組糖蛋白CHO攪拌，懸浮，反復批式培養(yǎng)無血清Interferon21anAvonex治療復雜性硬化Biogen5ni7n96重組糖蛋白CHO攪拌，懸浮培養(yǎng)無報道疫苗輪狀病毒W(wǎng)yethLaboratories8n3in98肝過濾病毒疫苗FRhL22Notrevealed含胎牛血清狂犬病毒ChironBehring10H20H97滅活狂犬病毒無報道無報道無報道甲肝疫苗Merck&Co3H29H96滅活病毒人二倍體纖維母細胞Adherent,NCFtoCostarCubes連續(xù)流加培養(yǎng)含血清組織培養(yǎng)產(chǎn)品自體同源培養(yǎng)chondrocytesnCarticel軟骨缺陷修復GenzymeTissueRepair8H22H97自體同源細胞軟骨細胞組織培養(yǎng)餅含血清診斷試劑產(chǎn)品人T淋巴細胞病毒用于酶聯(lián)ELISAAbbottLaboratories8H15H97抗體慢性感染人T、B淋巴細胞無報道無報道Capromabpendetide腫瘤診斷Cytogen10n28n96鼠IgG1雜交瘤中空纖維反應口口器無血清含牛血清白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白NofetumomabnVerluma腫瘤診斷DrKarlThomae8n20n96鼠IgG2bFab抗體雜交瘤無報道無血清Imciromabpentetate心肌診斷Centocor7n3n96鼠IgG2Fab抗體雜交瘤無報道血清，含慶大酶素a2000年至今又有7個動物細胞表達的重組蛋白和抗體藥物被FDABLA批準，但因多數(shù)無有關(guān)工藝的報道，此表未顯示產(chǎn)量與質(zhì)量，其生產(chǎn)形式至少70%是采用攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)形式,50%以上采用無血清培養(yǎng);疫苗和組織替代品其產(chǎn)品來源許多不用的細胞系，它需要特殊的生物反應器系統(tǒng)和培養(yǎng)液;雖然用于診斷的產(chǎn)品主要是單克隆抗體,類似于重組治療，但需求量明顯低,這就允許考慮多種特殊的生產(chǎn)形式和生物反應器系統(tǒng)。因此,目前用哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白的工業(yè)化過程，可以看作是以攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)作為通用技術(shù)平臺，使用常用的3種細胞（CHO、SP2n0、NSO依托該平臺工藝并使其生產(chǎn)能力提高。平臺工藝的特點是采用無血清培養(yǎng)和成熟的流加和灌流工藝。2目前公開發(fā)表工藝的研究目前被批準的生物技術(shù)產(chǎn)品以及公開發(fā)表的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，都建立在這個產(chǎn)品進入臨床研究之前，因此這些技術(shù)不代表當前動物細胞研究發(fā)展的趨勢，在工業(yè)化逐級放大生產(chǎn)過程中有些已體現(xiàn)出一定的滯后問題［3］。2中國生物工程雜志第23卷當前哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝中占有主流優(yōu)勢的是懸浮攪拌式培養(yǎng)工藝,特別是在重組治療性蛋白和抗體的規(guī)?；a(chǎn)。在工業(yè)化生產(chǎn)中,懸浮培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制比其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，因此在規(guī)?；瘎游锛毎囵B(yǎng)生產(chǎn)中多選擇懸浮細胞培養(yǎng)工藝（表1。Moran等［4］和Schenerman等［5］懸浮流加培養(yǎng)CHO、NSO細胞，在I2III期臨床研究單抗的生產(chǎn)放大中使用了202452100L生物反應器,工業(yè)化生產(chǎn)放大到50022000210000L，放大過程的工藝性能和產(chǎn)品特點都非常相似。Sauer等用攪拌式生物反應器，無血清流加培養(yǎng)SP2n0、NSO細胞生產(chǎn)人源化IgG抗體,工藝優(yōu)化過程從3L215L2750L直接放大,其細胞密度,特異性抗體產(chǎn)生率和產(chǎn)品質(zhì)量非常相似。作者認為一個好的細胞培養(yǎng)平臺系統(tǒng)可適用于許多不同重組蛋白或抗體的生產(chǎn),選擇適宜的平臺系統(tǒng)可有意義地減少工藝過程所需的時間［6］。懸浮貼壁細胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法是采用轉(zhuǎn)瓶、堆積床和微載體懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶和堆積床培養(yǎng)的放大生產(chǎn)受到很大的限制,懸浮微載體培養(yǎng)是目前疫苗生產(chǎn)常采用的一種形式。Wiktor等用懸浮微載體培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)狂犬疫苗，初始工作種子在1L生物反應器培養(yǎng),然后是放大至5L225L2150L生物反應器，以后還可在放大到1000L或采用多個150L的生物反應器，最后有效地感染病毒［7］。非傳統(tǒng)的貼壁細胞培養(yǎng)選用氣升式生物反應器、膜透析生物反應器和填充床灌流培養(yǎng)等。211懸浮細胞培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)適于許多細胞培養(yǎng)，如雜交瘤、鼠骨髓瘤（SP2n0,NSO,對適于貼壁培養(yǎng)的細胞（CHO,BHK可進行細胞生長形式的馴化。目前已發(fā)表的大量文獻,就繼續(xù)深入研究和進一步解釋如何提高單位細胞的生產(chǎn)力;如何優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境獲得最高的產(chǎn)量,同時保持最好的產(chǎn)品質(zhì)量;如何去除培養(yǎng)液中動物來源的成分，使大規(guī)模生產(chǎn)中的污染最小化;如何控制培養(yǎng)過程中的CO2的積累等進行了論述。在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的最大障礙,由于在懸浮培養(yǎng)工藝中，細胞的死亡主要是因凋亡所致。通過導入凋亡抑制基因（Bcl22來調(diào)節(jié)細胞抗凋亡的機制，延長細胞生存時間，促細胞活力和增加抗體的產(chǎn)量［8］。懸浮培養(yǎng)工藝中影響細胞生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量的因素，主要應考慮細胞培養(yǎng)環(huán)境（營養(yǎng)條件、產(chǎn)物積累、pH、溫度和滲透壓，終產(chǎn)物（乳酸和氨毒性累積和必需營養(yǎng)物的添加等。設(shè)計適應細胞生長的無血清培養(yǎng)基，控制營養(yǎng)物的添加，減少產(chǎn)物消耗積累是解決問題的有效手段。1996年Xie等［9］運用化學計量法，根據(jù)動物細胞生長的需求,設(shè)計定量添加濃縮的培養(yǎng)液，將葡萄糖、谷氨酰氨的濃度維持在一個低水平，以改變細胞代謝方式。在雜交瘤細胞流加培養(yǎng)周期超過550h，比較一般流加工藝特異性乳酸生成率減少了4倍,特異性氨生成率減少了10倍，細胞密度5x107nml，峰值的活細胞密度大于115x107nml,抗體累積濃度為214mgnml［10］。細胞培養(yǎng)過程的有效工藝參數(shù)控制,Enda等在兩組流加懸浮培養(yǎng)的不同工藝參數(shù)控制（如pH,溫度，結(jié)果溫度控制為34°C比較37°C,平均生長率降低而特異產(chǎn)物生產(chǎn)率提高;當細胞外pH維持在＞812和＜619時，重組蛋白的糖基化將發(fā)生有意義的改變［11］。另外有許多報道,批式培養(yǎng)在高滲透壓環(huán)境可增加抗體濃度。高滲透壓不僅影響抗體的產(chǎn)量，還影響生長速率,生長指數(shù)持續(xù)時間和細胞的死亡率。滲透壓范圍在350-400mOsm,特異性抗體產(chǎn)生率可較多地補償細胞生長率和最大細胞密度的減少,以得到理想的最終抗體濃度［12］。確保產(chǎn)品質(zhì)量與無血清培養(yǎng)工藝的一致性是當前重組蛋白生產(chǎn)中最為關(guān)注的問題［3］。Schenerman等在人源化抗體（Synagis放大生產(chǎn)過程中，用3個評價工藝參數(shù)（最大反應體積的群體倍增時間;低糖培養(yǎng)條件;回收后穩(wěn)定時間對工藝放大過程進行了相似性比較研究，以確認工藝放大與產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。結(jié)果顯示在生物反應器逐級放大過程的早期，抗體表達存在著不同的糖基化形式;培養(yǎng)環(huán)境和條件的變化對細胞系的穩(wěn)定性和抗體結(jié)構(gòu)、活性滴度都沒有影響［5］。對于攪拌的剪切損害可通過反應器的優(yōu)化被減少，另外在培養(yǎng)液中添加剪切保護劑,PluronicF68是使用最為廣泛、研究最多的保護性多聚體，它可在細胞與氣泡的接觸面形成保護層,以減少動力學表面的張力。212貼壁細胞培養(yǎng)貼壁細胞培養(yǎng)主要解決工藝放大的問題。微載體無消化直接接種細胞的有關(guān)研究,Zhang等用3第7期米力等:動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白的工藝選擇一個3L?15L攪拌生物反應器內(nèi)置一個旋轉(zhuǎn)過濾器，灌流微載體培養(yǎng)CHO細胞生產(chǎn)重組人單核細胞集落刺激因子（hSTC,連續(xù)培養(yǎng)2個月,其工藝特色是直接接種微載體培養(yǎng)無細胞消化一步，在工藝中需要反復優(yōu)化增加微載體的表面積和高微載體濃度下的攪拌形式。確保產(chǎn)品質(zhì)量與培養(yǎng)工藝的一致性對貼壁細胞培養(yǎng)同樣至關(guān)重要。Zhang等用完全相同的hSTC全長cDNA克隆baculovirus轉(zhuǎn)染SF29昆蟲細胞表達，在60L生物反應器生產(chǎn)，雖然生產(chǎn)方法和微載體灌流培養(yǎng)CHO細胞的產(chǎn)量相似，但CHO細胞生產(chǎn)的hSTC和SF29昆蟲細胞生產(chǎn)的hSTC有不同的糖基化形式,因此說明糖基化形式對哺乳動物細胞表達產(chǎn)品的生產(chǎn)非常重要［13］。目前報道的貼壁細胞生產(chǎn)工藝，最佳的生物反應器形式是攪拌式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，最大放大到10000L，并可提供最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的流加工藝設(shè)計。最佳的工藝設(shè)計是高密度連續(xù)灌流培養(yǎng),最近在30L生物反應器高密度微載體連續(xù)灌流培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)人狂犬疫苗，微載體數(shù)量達到25gnL細胞密度可以達到12x109nml,這項技術(shù)的進步主要是生物反應器提供一個獨特的細胞沉降系統(tǒng)，高氧氣傳輸系統(tǒng),和高營養(yǎng)環(huán)境及強的pH緩沖體系［14］。流加培養(yǎng)（fed2batch和灌流培養(yǎng)（perfusion是動物細胞培養(yǎng)工藝中最常用的兩種操作方式。另外可供選擇的方式還有批式2反復流加（batch2refeedingo雖然許多較老的病毒生產(chǎn)工藝采用批式操作（batch，新的病毒疫苗生產(chǎn)已采用改良的生產(chǎn)形式如批式2反復流加或灌流培養(yǎng)工藝。流加培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)是用攪拌生物反應器，營養(yǎng)物的添加主要考慮減少代謝廢物的積累和營養(yǎng)的均衡,維持一個高細胞密度和高產(chǎn)物濃度。灌流懸浮培養(yǎng)在生物反應器的設(shè)計上必須考慮細胞截流。流加懸浮培養(yǎng)與灌流懸浮培養(yǎng)在操作形式上并無明顯不同，兩種操作形式的選擇完全取決于每個產(chǎn)品潛在的細胞生長活力與相關(guān)產(chǎn)物的穩(wěn)定性,以及產(chǎn)品的最高產(chǎn)量需求和質(zhì)量要求。213懸浮和貼壁細胞生產(chǎn)工藝的共性問題近年來有許多有關(guān)動物細胞批式培養(yǎng)生產(chǎn)工藝中在線監(jiān)控的研究，限制氧氣供給,通過氧氣測定優(yōu)化添加工藝的研究［15］。有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的代謝和生理學研究以往多集中在乳酸和氨,在工業(yè)化生產(chǎn)尤其在高細胞密度時,CO2的積累可產(chǎn)生毒性或改變細胞的代謝。Garnier等的結(jié)果是CHO細胞可耐受的最大CO2濃度為33%（250mmHg時,C02濃度18%時細胞生長受到抑制。動物細胞通過在線監(jiān)控氧氣吸收率以控制優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境,C02溶解率的監(jiān)測與控制是通過控制最小氧氣需求量而實現(xiàn)的,BjornFrahm等,用“關(guān)氣”法測定哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)的溶解CO2濃度和HCO3濃度以及CO2產(chǎn)生率。Pattison等報道用一個在線C02溶解率分析（YSI8500在哺乳動物細胞和微生物發(fā)酵工藝中的應用，在30-2000L攪拌反應器微載體懸浮培養(yǎng)，結(jié)果證明C02積累對細胞生長、產(chǎn)物提高都是不利的,使用純氧微通氣以避免過多氣泡傷害,通過在線分析CO2溶解率，以氮氣調(diào)節(jié)控制溶解CO2的積累［16］。動物細胞培養(yǎng)過程的污染，在規(guī)?；a(chǎn)中一直是不可低估的問題。污染原因極有可能是病毒或培養(yǎng)液中動物組織潛在的一些轉(zhuǎn)染物，其它污染主要來源于不完善的工藝條件，被動的控制方法是使用抗生素，在商業(yè)化產(chǎn)品中抗生素的含量也存在著潛在的危險［17］。無血清無蛋白培養(yǎng)一直是動物細胞培養(yǎng)的研究主題。動物血清成分添加培養(yǎng)在工業(yè)化生產(chǎn)過程中已逐漸被FDA限制。細胞起始在培養(yǎng)小瓶馴化無血清條件，后來放大到生物反應器懸浮培養(yǎng)最終要形成小的團塊。無蛋白和無膽固醇培養(yǎng)已成功地培養(yǎng)雜交瘤和轉(zhuǎn)染谷氨酸合成酶的骨髓瘤細胞系NS0（正常膽固醇缺陷株用于生產(chǎn)人單克隆抗體［18］。貼壁細胞的無血清無蛋白培養(yǎng)通常需挑選特殊的克隆，再克隆或適應每個新克隆。通過分子遺傳途徑解決細胞依賴血清生長因素,CH02K1細胞系轉(zhuǎn)染胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因，細胞依賴自身合成所需的生長成分而有效生長［19］。最為理想和有希望的研究是用機器人自動控制生物反應器,Lutkemeyer等已經(jīng)成功顯示機器人可執(zhí)行20?100L反應器的無菌取樣程序和提交樣品到指定的分析儀器［20］。3結(jié)論回顧當前動物細胞規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝中占有主流優(yōu)勢的是攪拌式生物反應器4中國生物工程雜志第23卷懸浮培養(yǎng),工藝設(shè)計是流加或灌流培養(yǎng)。就美國FDABLAs批準公開的工藝，在動物細胞生產(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝選擇可考慮使用以上較成熟的工業(yè)化支持技術(shù)平臺,除少數(shù)特殊細胞系對工藝設(shè)計選擇的多樣性，對同類產(chǎn)品或同類細胞進行工藝研發(fā)和放大，以縮短產(chǎn)品工藝研發(fā)的時間，加快工業(yè)化進程。當前大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)所面臨的挑戰(zhàn)，是獲得最大生產(chǎn)力的同時注重維持產(chǎn)品的質(zhì)量;去除所有培養(yǎng)環(huán)境中外源因子的污染,更為精確有效的工藝控制手段,規(guī)?；囵B(yǎng)中氧氣的限定與溶解C02濃度累積的控制等。參考文獻MorrowKJ.Antibodyproduction.GeneticEngineeringNews,2001,21(7:1Wei2ShouHu,JohnGA.Large2scalemammaliancellculture.CurrentOpinioninBiotechnology.1997,8:148~153ChuLily,DavidKR.Industrialchoicesforproteinproductionbylarge2scalecellculture.CurrentOpinioninBiotechnology,2001,12:180~187MoranEB,McGowanST,McGuireJM,etal.Asystematicapproachtothevalidationofprocesscontrolparametersformonoclonalantibodyproductioninfed2batchcultureofamurinemyeloma.BiotechnolBioeng,2000,69:242~255SchenermanMA,HopeJN,Kletke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