二代測序NGS培訓(xùn)班課件 2傅啟華 NGS應(yīng)用于遺傳性疾病分子診斷（福州）

下一代測序技術(shù)

在遺傳性疾病分子診斷中的應(yīng)用

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所上海兒童醫(yī)學(xué)中心精準(zhǔn)醫(yī)療實(shí)驗(yàn)診斷中心傅啟華OMIM共收錄約7000種遺傳性疾病;雖然單個遺傳性疾病的發(fā)病率并不高（因此通常稱之為罕見?。?，但總體發(fā)病率并不低;罕見?。╮aredisease）：受累患者數(shù)量少于200,000（美國）遺傳性疾病的分類及發(fā)病率遺傳性疾病患者總體數(shù)量大缺乏準(zhǔn)確的流行病學(xué)基礎(chǔ)信息診斷率低逐漸引起重視我國已開始加快遺傳性疾病相關(guān)研究工作遺傳性疾病基因檢測的目的性分類新生兒篩查：PKU、CAH診斷性檢測：骨病、地貧攜帶者篩查：地貧、HA預(yù)見性檢測：癌、心血管癥狀前檢測：亨廷頓病、阿爾茨海默病“Nextgenerationsequencing”PubmedsearchingthismorningIonTorrent測序技術(shù)NGS實(shí)驗(yàn)主要涉及三個步驟:測序文庫制備,測序及數(shù)據(jù)分析Contributionofdifferentfactorstotheoverallcostofasequencingprojectacrosstime下一代測序?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)分析流程原始測序數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)遺傳變異變異信息的高級分析3,000,000-4,000,000variants20,000-50,000variants5,000variants150-500VariantspresentinagenomeVariantsinanexomeVariantsaftercallingqualityrecalibratedVariantsafterdbSNP,TG,ESP,andin-housedatabasefilteringPutativecausalvariants(Biologyanalysis)全外顯子組測序數(shù)據(jù)分析各階段的變異數(shù)量變異的篩選策略Gilissenetal.EurJHumGenet.201220(5):490-497變異分類及報告策略臨床分子診斷遺傳變異結(jié)果報告和解釋中常用資源下一代測序（NGS）已逐漸應(yīng)用于臨床分子診斷不同規(guī)模的NGS實(shí)驗(yàn)在臨床分子診斷中的應(yīng)用全基因組測序（Genome）：產(chǎn)前診斷全外顯子組測序（Exome）：發(fā)現(xiàn)、鑒定致病基因靶向目標(biāo)基因測序（Panel）：臨床分子診斷FortheFirsttime:Whole-GenomeSequencingDeliversNewTreatmentOptionsforTwinswithRareGeneticMovementDisorderNGS在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病分子診斷中的應(yīng)用(1)將NGS技術(shù)作為常規(guī)診斷試驗(yàn)進(jìn)行候選基因突變篩查對于神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病患者的臨床診療和遺傳咨詢具有重要價值NGS在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病分子診斷中的應(yīng)用(2)DMD和BMD是最常見的NMDDMD基因巨大，常規(guī)方法難度大89例DMD和BMD患者，18例女性攜帶者和245例非DMD患者CNV：99.99%精確性

和98.96%敏感性SNV：100%準(zhǔn)確率9例患者發(fā)生部分外顯子缺失，可知精確斷裂位置信息NGS在視網(wǎng)膜疾病分子診斷中的應(yīng)用（1）作者病例數(shù)基因數(shù)臨床診斷基因診斷率Neveling,etal.100111視網(wǎng)膜變性36%Audo,etal.20254遺傳性視網(wǎng)膜病家系57%Bowne,etal.2146常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜變性家系24%Glockle,etal.170105遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良55%～80%Wang,etal.123163視網(wǎng)膜變性37%Fu,etal.31163常染色體隱性視網(wǎng)膜變性家系40%較之傳統(tǒng)的分子診斷方法（如采用Sanger測序技術(shù)逐個基因進(jìn)行分析），NGS能夠有效提高各種類型視網(wǎng)膜疾病分子診斷的能力和效率；同時能有效減低分子診斷的費(fèi)用NGS在視網(wǎng)膜疾病分子診斷中的應(yīng)用（2）Glockle,etal.EurJHumGenet(2014)22,99–104105個已知視網(wǎng)膜疾病致病基因組成的NGS診斷panel107例臨床未經(jīng)篩選的視網(wǎng)膜疾病患者視網(wǎng)膜變性患者的分子診斷率：55%Bardet–Biedl綜合征或Usher綜合征患者：80%均發(fā)現(xiàn)致病或候選致病變異NGS在血液系統(tǒng)疾病分子診斷中的應(yīng)用NGS已成功應(yīng)用于范可尼貧血、VWD等血液系統(tǒng)疾病的分子診斷NGS在遺傳病攜帶者檢測中的應(yīng)用利用NGS技術(shù)，能對嚴(yán)重影響兒童健康的遺傳病進(jìn)行全面、系統(tǒng)篩查NGS在線粒體疾病分子診斷中的應(yīng)用42例經(jīng)常規(guī)基因檢測未能診斷的嬰兒型線粒體病此panel包含線粒體基因組、100個已知線粒體病致病基因及1000個與線粒體功能相關(guān)基因與正常人相比，患者群體中具有功能影響的變異（罕見變異、影響蛋白功能的變異及隱性遺傳的變異）負(fù)荷增加了5倍55%存在隱性基因突變或致病性線粒體基因突變：10例（24%）患者進(jìn)行明確的分子診斷；

13例（31%）患者出現(xiàn)核基因突變，其中2例患者的突變經(jīng)功能研究發(fā)現(xiàn)可疑引起線粒體病Baby’sDNAinmother’sbloodNGS在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用利用NGS技術(shù)對孕婦外周血中的cfDNA進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（noninvasiveprenataltesting,NIPT）已成為該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢基于孕婦外周血無細(xì)胞血漿胎兒DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的21三體（0.3%vs.3.6%,P<0.001）和18三體（0.2%vs.0.6%,P=0.03）的假陽性率遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查NIPT能夠檢出全部攜帶常染色體異倍體的孕婦，陰性預(yù)測值為100%（95%CI：99.8%～100%）同時，NIPT對21三體（45.5%vs4.2%）和18三體（40.0%vs8.3%）的陽性預(yù)測值顯著高于標(biāo)準(zhǔn)篩查方法可以作為常染色體異倍體篩查的一線方法NEnglJMed.

2014Feb27;370(9):799-808WES用于出血病患者的分子診斷病人資料患者，女性，臨床類似血友病出血表現(xiàn)用凝血酶原復(fù)合物治療有效DIC、凝血因子活性檢測均正常VWD排除血小板功能正常其弟與其有相似的臨床出血表現(xiàn)，父母為近親婚配遺傳性出血性疾病（凝血因子功能缺陷？）NGS結(jié)果631A>C,211T>P

F10基因表型診斷APTT:

50.2sFⅤ:124.9%PT:

11.3sFⅧ:76.7%INR:

0.98FⅪ:118.7%FIB:

3.71g/LFⅫ:80.7%FⅡ:

109.8%FⅦ:

100.4%FⅨ:72.0%FⅩ(PT法):

108.3%FX:C（APTT法）=4.36%病人凝固時間=76.7sThrombHaemost.2013Jul;110(1):53-61.

發(fā)色底物法：FX:C=109.4%病人OD405=0.3565遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)屈曲畸形遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)屈曲畸形（Distalarthrogryposis，DA）是一種先天性多發(fā)性關(guān)節(jié)攣縮畸形遺傳病，主要表現(xiàn)為2個或2個以上關(guān)節(jié)的攣縮畸形，并且不包括神經(jīng)和肌肉疾病所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)畸形。典型的臨床特點(diǎn)：手部關(guān)節(jié)屈曲畸形、手指重疊及手指向尺側(cè)測斜；馬蹄內(nèi)翻足，仰趾外翻足，垂直距骨；腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等先天性屈曲伴活動受限，髖關(guān)節(jié)脫位等。目前，至少將DA分為10種亞型，所有DA亞型具有一些共同的表現(xiàn)：手足均受累及、近端關(guān)節(jié)較少受影響、表現(xiàn)度（expressivity）不一DA致病機(jī)制迄今，已鑒定出至少10個基因突變與DA有關(guān)TypeGeneDA1TPM2,MYBPC1,TNNI2,MYH3DA2AMYH3DA2BTNNT3,TNNI2,MYH3,TPM2DA3PIEZO2DA5PIEZO2,ECEL1DA6FGFR3DA7MYH8DA9FBN2案例先證者為2歲男孩，其父母非近親婚配。出生后即發(fā)現(xiàn)雙手雙足畸形，但生長發(fā)育未見明顯異常，于2012年10月上旬到我院骨科門診就診。骨科門診檢查發(fā)現(xiàn)先證者雙手?jǐn)伩s，雙手拇指內(nèi)收且拇指比正常長，不能伸直，但雙手具備基本功能；雙足攣縮，不能走路，其余檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常。先證者姐姐同樣具有先天性雙手雙足畸形，且雙足已經(jīng)手術(shù)矯正但效果欠佳；先證者父親患有雙手畸形，雙足正常，余無殊。先證者母親G3P2，頭胎女兒出生后即死亡，但死嬰是否患有此類手足畸形情況不明?；純耗赣H孕期正常，為自然順產(chǎn)。先證者父母否認(rèn)雙方親屬有遺傳病史。先證者及其受累家系成員經(jīng)過詳細(xì)體檢和檢查均未發(fā)現(xiàn)其他明顯異常。MoleculardefectidentifiedbyWESinapedigreeofdistalarthrogryposis共得到286個候選致病變異初步確認(rèn)TNNI2基因（NM_003282）c.533T>G（p.F178C）是該家系的致病突變是TNNI2基因的新突變。該變異經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，并與疾病表型完全共分離TNNI2c.533T>G,p.F178CF178C突變位于TNNI2蛋白的C-末端，位點(diǎn)具有高度進(jìn)化保守性phyre2工具分析表明，該突變可導(dǎo)致TNNI2蛋白二級結(jié)構(gòu)的改變診斷DA是一組臨床表現(xiàn)和遺傳病因均高度異質(zhì)的疾病。同時，由于不完全外顯、表現(xiàn)度不一、不同DA亞型存在臨床表現(xiàn)的重疊以及缺乏對不同亞型自然病程的了解，對DA的鑒別診斷和分型、尤其是DA1、DA2B/SHS和DA2A/FSS造成很大的困擾。實(shí)際上，相同亞型的DA患者其臨床表現(xiàn)也各不一樣，甚至在同一個DA家系中多個患者罹患不同亞型的DA，因此為DA1、DA2B和DA2A是同一種疾病的連續(xù)表現(xiàn)形式這一認(rèn)識提供了證據(jù)。在本研究中，先證者及先證者姐姐均表現(xiàn)雙手手指屈曲畸形、大拇指偏長、雙馬蹄內(nèi)翻、不能行走、小下頜畸形；此外，未見嘴唇撅起、明顯鼻唇溝、短頸、矮小、智力低下、小嘴等異常表現(xiàn)。先證者父親僅出現(xiàn)雙手手指屈曲畸形，未見其他明顯可見異常表現(xiàn)。根據(jù)該家系臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，我們最終將其診斷為DA2B。NGS應(yīng)用于疾病基因診斷存在的問題基因變異致病性的確定（缺乏統(tǒng)一、精確注釋、經(jīng)審核的基因型-表型數(shù)據(jù)庫;文獻(xiàn)報道中有27%的致病變異實(shí)為多態(tài)性或注釋錯誤Sci.Transl.Med.2011,3,65ra4）偶然發(fā)現(xiàn)結(jié)果的報告（ACMG指南及引發(fā)的爭議）二代測序?qū)嶒?yàn)中目的片段測序的不完整性（可能丟失致病性變異）缺少非編碼區(qū)域致病性變異的發(fā)現(xiàn)工具和知識利用NGS進(jìn)行遺傳病分子診斷的質(zhì)量控制在應(yīng)用NGS進(jìn)行遺傳病的分子診斷過程中，必須對NGS實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析的各個方面進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制以保證結(jié)果的真實(shí)、可靠ArchPatholLabMed.doi:10.5858/a