生化實(shí)驗(yàn)電泳

生化實(shí)驗(yàn)電泳第1頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)思路蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有哪些？蛋白質(zhì)的分離方法有哪些？本次實(shí)驗(yàn)利用了哪個(gè)性質(zhì)？

生物化學(xué)教研室朱欣婷第2頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理；2.掌握醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白的原理和方法；3.進(jìn)一步熟悉721型分光光度計(jì)的使用

生物化學(xué)教研室朱欣婷第3頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析

生物化學(xué)教研室朱欣婷第4頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）電泳技術(shù)(electrophoresis)電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其電性 相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù):指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分 析的技術(shù)。

生物化學(xué)教研室朱欣婷第5頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、電泳的原理以蛋白質(zhì)為例：H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI

生物化學(xué)教研室朱欣婷第6頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳速度:帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以u(píng)表示，即

V—粒子運(yùn)動(dòng)的速度X—電場(chǎng)強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度

生物化學(xué)教研室朱欣婷第7頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子帶電量：分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子分子大?。?/p>

生物化學(xué)教研室朱欣婷Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；第8頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強(qiáng)度(I)：I越大，電動(dòng)電勢(shì)越小，u越小；I越小，電動(dòng)電勢(shì)越大，u越大，但樣品易擴(kuò)散。離子強(qiáng)度如果過(guò)低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.02～0.2之間。

生物化學(xué)教研室朱欣婷第9頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電場(chǎng)強(qiáng)度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢(shì)梯度。3.電場(chǎng)強(qiáng)度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。電場(chǎng)強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時(shí)候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無(wú)法分離。

生物化學(xué)教研室朱欣婷第10頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4.支持介質(zhì)：目前常用的電泳支持物：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)

生物化學(xué)教研室朱欣婷第11頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六負(fù)極正極－－－－－－－－表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng)

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場(chǎng)作用下液體對(duì)固體支持物相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋

生物化學(xué)教研室朱欣婷以紙電泳為例:第12頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可分為：1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。三、區(qū)帶電泳的分類

生物化學(xué)教研室朱欣婷第13頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤(pán)狀電泳

生物化學(xué)教研室朱欣婷第14頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六(三)按pH的連續(xù)性不同，區(qū)帶電泳可分為：1．連續(xù)pH電泳：即整個(gè)電泳過(guò)程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電脈，等電聚焦電泳等。

生物化學(xué)教研室朱欣婷第15頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（二）血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳

生物化學(xué)教研室朱欣婷第16頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六【實(shí)驗(yàn)原理】

1.血清中幾種主要蛋白組分血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量占總蛋白的％清蛋白4.6469,00057～72α1－球蛋白5.06200,0002～5α2－球蛋白5.06300,0004～9β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pI＜pH血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)

生物化學(xué)教研室朱欣婷第17頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六血清蛋白依次分為清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五個(gè)區(qū)帶請(qǐng)預(yù)測(cè)血清蛋白電泳區(qū)帶圖清蛋白α1γα2β

生物化學(xué)教研室朱欣婷第18頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六膜條經(jīng)過(guò)氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定量

生物化學(xué)教研室朱欣婷各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_(kāi)，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。第19頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義：

生物化學(xué)教研室朱欣婷臨床上還可用A/G比來(lái)表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.5可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*第20頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1．準(zhǔn)備與點(diǎn)樣：取兩條2.5×8cm的膜條充分浸透在巴比妥緩沖液中取出膜條濾紙吸去多余的緩沖液無(wú)光面距一端1.5cm處作點(diǎn)樣線點(diǎn)樣器下端粘上薄層血清垂直點(diǎn)樣

生物化學(xué)教研室朱欣婷第21頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六放置膜條平衡5分鐘通電關(guān)閉電源2．電泳點(diǎn)樣面向下點(diǎn)樣端置于陰極膜條貼緊濾紙，拉直膜條電壓：160v時(shí)間：60min

生物化學(xué)教研室朱欣婷第22頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六通電完畢浸于染色液（氨基黑10B）中取出膜條浸于漂洗液Ⅰ3．染色、脫色取出膜條5min浸于漂洗液Ⅱ2min5min浸于漂洗液Ⅲ濾紙吸干薄膜5min直至漂凈

生物化學(xué)教研室朱欣婷第23頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六取試管6支編號(hào)1~6４.定量(兩人的膜條共用)試管編號(hào)

Aα1α2βγ00.4mol/LNaOH6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白條帶清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白無(wú)蛋白區(qū)充分振蕩脫凈染料比色定量

生物化學(xué)教研室朱欣婷第24頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1．計(jì)算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。

清蛋白％＝（2A/∑T）×100％ α1球蛋白％＝（α1

/∑T）×100％ α2球蛋白％＝（α2

/∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/∑T）×100％光密度總和T＝2A＋α1＋α2＋β＋γ2．計(jì)算出清蛋白與球蛋白之比值（2A/G）

G=α1＋α2＋β＋γ

生物化學(xué)教研室朱欣婷第25頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.點(diǎn)樣面為不光滑面，勿用手觸摸感知；2.點(diǎn)樣量適中，垂直點(diǎn)樣；3.點(diǎn)樣端接電泳儀負(fù)極；4.膜條與濾紙需貼緊，拉直；5.謹(jǐn)防觸電。

生物化學(xué)教研室朱欣婷第26頁(yè)，共28頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1．在本實(shí)驗(yàn)電泳過(guò)程中，正負(fù)電極各發(fā)生什么反應(yīng)?電極附近的緩沖液有什么變化?2.電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極？為什么？3.除利用電泳法分離蛋白質(zhì)以外,還有哪些分離方法?4.簡(jiǎn)單繪制血清蛋白電泳后的譜圖。