實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)第1頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六

一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要聯(lián)接方式。

2.了解蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)原理。

3.學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)的方法。第2頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)原理(一)雙縮脲反應(yīng)

1原理尿素加熱至180℃左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。

第3頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六

第4頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六

(二)茚三酮反應(yīng)除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，是一種常用的氨基酸定量測定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原性茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。第5頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六加熱第6頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六第7頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六

（三）黃色反應(yīng)在蛋白質(zhì)分子中，具有芳香環(huán)的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)殘基上的苯環(huán)經(jīng)硝酸作用可生成黃色的硝基化合物，在堿性條件下生成物可轉(zhuǎn)變?yōu)樯畛壬牡南貂苌铮磻?yīng)為：

第8頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以都會(huì)發(fā)生黃色反應(yīng)。苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸后才能夠發(fā)生黃色反應(yīng)。第9頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六

(四)考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)

考馬斯亮藍(lán)G250具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色：當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變成藍(lán)色。它染色靈敏度高。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時(shí)間達(dá)到平衡，在室溫一小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。在0.01-1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量。第10頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)試劑1蛋白質(zhì)溶液500毫升；20.1％茚三酮水溶液250毫升；3濃硝酸；410%NaOH溶液250毫升；5尿素；61％硫酸銅溶液250毫升；70.01％考馬斯亮藍(lán)染液100毫升第11頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)操作（1）取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10％氫氧化鈉溶液約1毫升，振蕩混勻，再加1％硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。（2）向另一試管加卵清蛋白溶液約10滴和10％氫氧化鈉溶液約10滴，搖勻，再加1％硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。

第12頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六

(3)取試管1支，加入蛋白質(zhì)溶液1ml，然后各加入0.1％茚三酮水溶液5滴，混勻后于沸水浴中加熱1-2分鐘，觀察顏色由有粉色變紫紅色再變藍(lán)。

(4)于一試管內(nèi)，置蛋白質(zhì)溶液10滴，濃硝酸3-4滴，微火加熱，冷卻后于室溫下逐滴加入10%NaOH溶液5滴，觀察顏色變化。第13頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六

(5)操作方法管號(hào)蛋白質(zhì)溶液（ml）

蒸餾水（ml）

考馬斯亮藍(lán)染液（滴）

10222112第14頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六注意事項(xiàng)1試管加熱時(shí)，試管一般與桌面成45°角，加熱時(shí)切不可對(duì)著任何人.要用試管夾夾住試管。2雙縮脲反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，硫酸銅溶液不能滴加過量。第15頁，共17頁，2023年，2月20日，星期六思考題1請(qǐng)