中藥指紋圖譜建立的原則和步驟

PAGEPAGE4（一）建立指紋圖譜的一般原則

中藥指紋圖譜的建立，應以系統(tǒng)的化學成分研究和藥理學研究為依托，體現系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性三個基本原則。唯此，才能保證指紋圖譜的標準化、規(guī)范化、客觀化，從而便于推廣和應用。

1.系統(tǒng)性

是指指紋圖譜中反映的化學成分應包括該中藥有效部位所含大部分成分，或指標性成分的全部，如中藥兩頭尖中抗腫瘤的有效成分為皂苷類化合物，則其指紋圖譜應盡可能地反映其中的皂苷類成分；銀杏葉的有效成分是黃酮類和銀杏內酯類，則其指紋圖譜可采用兩種方法，針對這兩類成分分別分析，達到系統(tǒng)全面的目的。

2.特征性

是指指紋圖譜中反映的化學信息（如保留時間）應具有較強的選擇性，這些信息的綜合結果，將能特征性地區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，成為中藥自身的“化學條碼”。如北五味子的HPLC指紋圖譜和TLC指紋圖譜，不僅包括多種的五味子木脂素類成分，而且具有許多未知類成分，這些成分的峰位順序、比值在一定范圍內是固定的，并且隨藥材品種不同而產生差異，依此可以很好地區(qū)別其來源、產地，判別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。

3.穩(wěn)定性

是指所建立的指紋圖譜在規(guī)定的方法、條件下的耐用程度，即不同操作者、不同實驗室所重復做出的指紋圖譜應在所允許的誤差范圍內，以體現其通用性和實用性。因而要求包括樣品制備、分析方法、實驗過程、數據采集、處理、分析等全過程都要規(guī)范化操作，同時，還應建立相應的評價機構，對其進行客觀評價。

（二）建立指紋圖譜的一般步驟

1.方案設計與思路

（1）研究對象的確定

在調研有關文獻、新藥申報資料(質量部分和工藝部分)及其它研究結果的基礎上，盡可能的詳盡地了解藥材、中間體及成品中所含成分的種類及其理化性質，綜合分析后找出成品中的藥效成分或有效成分，作為成品和中間體指紋圖譜的研究對象，即分析檢測目標。

例如，黃芪含黃酮、皂苷及多糖三類有效組分，黃芪多糖注射液及其中間體的指紋圖譜則以多糖為研究對象，黃芪原藥材的指紋圖譜應把黃酮、皂苷及多糖作為研究對象。

復方注射劑應根據君臣佐使的原則，以君藥、臣藥中的有效成分作為指紋圖譜的研究對象，佐使藥中的成分可采用其它指紋圖譜方法進行輔助、補充研究。

（2）研究方法的選擇

研究方法應根據研究對象的物理化學性質來選擇。大多數化合物可采用HPLC。例如黃芪中黃酮、皂苷、多糖等。揮發(fā)性成分應采用GC。例如魚腥草中的魚腥草素、土木香中的土木香內酯、異土木香內酯和二氫土木香內酯等。某些有機酸經甲酯化后亦可用GC分析。采用上述方法難以分離檢測的成分，可考慮使用TLC和CE。

5.實驗方法和條件的選擇

其目的是通過比較實驗，從中選取相對簡便易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現性和普遍適用性的要求。方法和條件須經過嚴格的方法學考察。例如穩(wěn)定性試驗，精密度試驗，重現性試驗等。

注意事項：供試液的制備和色譜分析時均須定量操作，以保證圖譜在整體特征上進行半定量(差異程度或相似程度)的比較。

指紋圖譜分析不同于含量測定，提高其分離度應以不犧牲色譜的整體特征為前提，故不應孤立地苛求分離度達到含量測定的要求。

采用HPLC和GC制定指紋圖譜，記錄時間一般為1小時。(實測2小時)

6.對照指紋圖譜及其技術參數的建立

(1)測得的大量色譜數據需經分析和數據處理，才能獲得對照指紋圖譜(擬合指紋圖譜)及其技術參數，以此作為藥品指紋圖譜檢驗的依據。

(2)技術參數主要包括總峰面積、共有峰序號、參照峰(S)、共有峰相對保留時間(RRT)，共有峰峰面積比(RA)，非共峰面積等。

RRT=RTi/RTs

RA=Ai/As

共有峰亦稱特征峰（包括參照峰），系指所有被檢批次中均含有的相同色譜峰，主要來源于樣品中主要有效成分或指標成分。共有峰的化學歸屬，可采用對照品加入法或HPLC/DAD/MS/MS聯(lián)用技術進行鑒別，后者可在無對照品的情況下使用。

例復方丹參注射液指紋圖譜應有9個特征峰

相對保留時間／分鐘(峰序號)：0．145(1)

0．186(2)

0．298(3)

0．378(4)

0．425(5)

0．499(6)

0．594(7)

1．000(s原兒茶醛)

1．145(8)

峰面積比值：0．059(1)

0．064(2)

0．036(3)

0.112±30％(4)0．054(5)

0．297±25％(6)

0．055(7)

1．000(s原兒茶醛)

0．040(8)

7.藥材、中間體和注射劑指紋圖譜的相關性

注射劑中各特征峰均可在藥材及中間體指紋圖譜中得到追蹤，中間體與注射劑的指紋圖譜應非常接近，藥材圖譜中的色譜峰應比注射劑多。必要時可采用加入某一藥材、有效部位或中間體的供試品，或制備某一藥材、有效部位或中間體陰性供試品的方法，標定各指紋圖譜之間的相關性。提供相關性研究的指紋圖譜。

8.指紋圖譜的評價

中藥指紋圖譜的評價系指將樣品指紋圖譜與建立起來的對照指紋圖譜進行相似性比較，從而對藥品質量進行評價和控制。

中藥指紋圖譜的評價不同于含量測定，它強調的是相似性(Similarity)，而不是相同性(Identity)，也即著重辨識完整圖譜“面貌”，而不是求索細