高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用

高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用第1頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三高效液相色譜

highperformanceliquidchromatograph，HPLC第2頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三第3頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三Agilent1100第4頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三氣相色譜法：較易揮發(fā)、且熱穩(wěn)定的有機(jī)化合物?！?0%液相色譜法：用氣相色譜法難以分析的物質(zhì)，如難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、分子量大、具有生物活性的物質(zhì)?！?0%第一節(jié)

高效液相色譜法的原理一、高效液相色譜法的特點第5頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜儀經(jīng)典液相色譜HPLC固定相粒徑150-200μm3-10μm流動相驅(qū)動方式重力或低壓泵高壓泵流動相流速很慢快(1-10mL/min)例：分離20種氨基酸柱長：170cm柱徑：0.9cmF：30mL/ht

:>20h經(jīng)典柱色譜HPLCt

：1h高壓、高效、高速第6頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三吸附色譜

分配色譜

離子交換色譜

排阻色譜二、高效液相色譜法的分類正相色譜

反相色譜1、按分離原理分類2、按極性分類第7頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三1)吸附色譜（液-固）固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相上的吸附與解吸。適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣。1、按分離原理分類第8頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三2)分配色譜（液-液）

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；固定相：由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體表面涂漬固定液，固定液易流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面。C-18柱:第9頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三3)離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂

或陽離子離子交換樹脂；流動相：酸性或堿性水溶液；基本原理：利用不同離子對樹脂的離子交換能力不同來實現(xiàn)分離。應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第10頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三4)排阻色譜（又稱凝膠色譜）

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快?？蓪ο鄬Ψ肿淤|(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。第11頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三1)正相色譜：

是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的色譜體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。2)反相色譜：

由非極性固定相和極性流動相所組成的色譜體系，與正相色譜體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今HPLC最主要的分離模式。2、按極性分類:第12頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三第13頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)高效液相色譜儀的組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第14頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三一、輸液系統(tǒng)

高壓輸液泵脫氣裝置梯度淋洗系統(tǒng)第15頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三1、高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。μL/min~幾千mL/min應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性第16頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三2、脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。脫氣機(jī)、超聲脫氣、真空脫氣等。

第17頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三3、梯度淋洗裝置第18頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑第19頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三分析時間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2等度洗脫怎樣解決呢？第20頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三梯度洗脫

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器

B泵AB時間B濃度第21頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三95%30%MeOH梯度洗脫優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度。第22頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三

氣相色譜的程序升溫第23頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三程序升溫50~250℃，8℃/min恒溫150℃正構(gòu)烷烴恒溫和程序升溫色譜圖比較程序升溫不僅可以改善分離，而且可以縮短分析時間。

氣相色譜：第24頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置：二、進(jìn)樣系統(tǒng)第25頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三色譜柱：填料：C18色譜柱十八烷基硅基化學(xué)鍵合到多孔硅膠或陶瓷微粒SIL多孔硅膠微粒XDB-C8辛基硅烷化學(xué)鍵合到多孔硅膠微粒上三、分離系統(tǒng)第26頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相。

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

Cc.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N化學(xué)鍵合固定相:第27頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三

1、紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

參考二極管UV燈光柵樣品池采樣二極管濾光片狹縫鏡2鏡1四、檢測系統(tǒng)第28頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三2、光電二極管陣列檢測器DAD紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。第29頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三3、熒光檢測器高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。第30頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三4、質(zhì)譜檢測器

第31頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三一、定性分析(1)保留值定性(2)相對保留值定性(3)與其他儀器聯(lián)用標(biāo)準(zhǔn)品：A-甲醇；B-乙醇；C-正丙醇；D-正丁醇；E-正戊醇第三節(jié)高效液相色譜法的應(yīng)用第32頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三組分的峰面積越大,在樣品中所占比例越大?1、校正因子定量：fi

稱為校正因子。fi

＝0？同一檢測器，對不同組分的敏感度不同。Wi=fiAiWi=fiAi二、定量分析方法：第33頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三校正因子fi分為絕對和相對校正因子兩種。絕對校正因子：由于受到儀器及操作條件的影響程度很大，實際定量分析時，基本上不使用。第34頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三

相對校正因子fi

：

某物質(zhì)i

與一選擇的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)S

的絕對校正因子之比:

相對校正因子只與檢測器類型有關(guān)，而與色譜條件無關(guān)。

常用于作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)S的有苯（熱導(dǎo)檢測器）和庚烷（氫火焰離子化檢測器）等。選擇的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)S一起加入試樣中——內(nèi)標(biāo)法：第35頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三2、內(nèi)標(biāo)法

——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在未知樣內(nèi)部內(nèi)標(biāo)物應(yīng)滿足的要求（p55)：準(zhǔn)確稱取一定量的未知樣Wi，加入已準(zhǔn)確定量的內(nèi)標(biāo)物WS。SampleStandardsi校正曲線：Ai/As～Ciis第36頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點：氯霉素測定：

1.用外標(biāo)法：

①先做氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，C=1ug/uL，進(jìn)樣量10uL,測得A=1000,

則W=1ug/uL×10uL=10ug,

f=W/A=10ug/1000=0.01ug;

②

再做未知樣(含氯霉素?ug/uL)，進(jìn)樣量10uL,測得Ax=500,

則Wx=f×Ax=0.01ug×500=5ug,

Cx=5ug/10uL=0.5ug/uL;

③

假若由于某種原因，未知樣實際進(jìn)樣量只有9.90uL,但計算時仍按10uL算：

則可測得Ax變?yōu)?95，Wx=fi×Ax=0.01ug×495=4.95ug,

Cx

=4.95ug/10uL=0.495ug/uL。

第37頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三2.用內(nèi)標(biāo)法：

①先做氯霉素(i)+對硝基苯酚(s)標(biāo)準(zhǔn)品，

標(biāo)準(zhǔn)品中，氯霉素Ci=1ug/uL，對硝基苯酚Cs=2ug/uL；

進(jìn)樣量10uL,測得氯霉素Ai=1000,對硝基苯酚As=100。

則氯霉素Wi=1ug/uL×10uL=10ug,fi=Wi/Ai=10ug/1000=0.01ug;

對硝基苯酚Ws=2ug/uL×10uL=20ug,fs=Ws/As=20ug/100=0.2ug;

相對校正因子f′=fi/fs=0.01ug/0.2ug=0.05;

②再做未知樣(氯霉素?ug/uL+對硝基苯酚0.5ug/uL)，進(jìn)樣量10uL,可測得氯霉素Ai=500,對硝基苯酚As=25,

f′=fi/fs=(Wi/Ai)/(Ws/As)=0.05;Ws=0.5ug/uL×10uL=5ug，

Wi=f′×(Ws/As)×Ai=0.05×(5/25)×500=5ug,

Cx=5ug/10uL=0.5ug/uL;

第38頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三③假若由于某種原因，導(dǎo)致未知樣實際進(jìn)樣量只有9.90uL,

但計算時仍按10uL算：

則可測得氯霉素Ai變?yōu)?95，對硝基苯酚As也變?yōu)?4.75；

f′=0.05;

Ws=0.5ug/uL×10uL=5ug；

Wi=f′×(Ws/As)×Ai

=0.05×(5/24.75)×495=5ug,

Cx=5ug/10uL=0.5ug/uL。

第39頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三例：一含氯霉素試樣，稱取此樣1.000g，以對硝基苯酚作內(nèi)標(biāo)，稱取0.100g對硝基苯酚加到試樣中，混合均勻后進(jìn)樣，測得氯霉素峰面積是20，對硝基苯酚峰面積是120，已知氯霉素相對于對硝基苯酚的相對校正因子是1.2，求試樣中氯霉素的含量。

fi

′

=（Wi

/20）/（0.100/120）=1.2

wi=0.020g

Ci

=

0.020/1.000=2.0%第40頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三

3、外標(biāo)法

——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在未知樣外部即標(biāo)準(zhǔn)曲線法。特點：

不必使用校正因子。

操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。第41頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三4、歸一化法：

i前提：所有組分都能從柱上洗脫并能被檢測器檢測。第42頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三例1、高效液相色譜法測定奶粉中的三聚氰胺（1）提?。悍Q取0.5~3g奶粉試樣，加入0.1mol/L鹽酸至15ml，混勻，超聲提取30min后加入60g/L磺基水楊酸3~4ml，再用0.1mol/L鹽酸定容至20ml，混勻后以4000r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。（2）分析：色譜柱:色譜柱KromasilKR100-5C8(250mm×4.6mm，5μm，EkaChemicals公司，瑞典)柱溫:40℃。流動相:緩沖液+乙腈(85+15，體積比);流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:20μl。二極管陣列檢測器，波長范圍200~400nm。第43頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三第44頁，共49頁，2023年，2月20日，星期三例2、液相色譜法測定食品中苯并(a)芘原理：樣品經(jīng)過提取、皂化以及柱層析凈化，除去脂肪類物質(zhì)、色素等雜質(zhì)后，再通過液相色譜儀中的色譜柱，將苯并芘從多環(huán)芳烴物質(zhì)中分離出來。求出樣品中苯并芘的含量。儀器：(1)液相色譜儀：色譜柱：ODS柱，柱長250mm，Φ4mm；

柱溫：30℃；流動相：75％甲醇；流速：2mL／min。(2)檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長369nm，熒光波長405nm。第45頁，共49頁，2023年，2月2