第七章化學酶工程-人工模擬酶

第七章化學酶工程-人工模擬酶第一頁，共46頁。模擬酶的概念及理論基礎(chǔ)模擬酶的分類印跡酶7.2酶的模擬第二頁，共46頁。模擬酶的概念及理論基礎(chǔ)模擬酶的分類分子印記酶的定義及影響分子印記酶選擇性識別的因素生物印記酶的原理本節(jié)重點第三頁，共46頁。7.2.1模擬酶的概念人工（模擬）酶：根據(jù)酶的催化原理，模擬酶的生物催化功能，用有機化學和生物學的方法合成具有專一催化功能的物質(zhì)。是在分子水平上模擬天然酶活性部位的結(jié)構(gòu)特征（包括：形狀、大小及其微環(huán)境），以及天然酶的作用機理和立體化學。第四頁，共46頁。酶學基礎(chǔ)：酶的結(jié)構(gòu)和酶學性質(zhì)。以高分子聚合物為母體，在適宜部位引入疏水基團，做成一個適于和底物結(jié)合的空腔，同時在適宜部位引入催化基團。化學基礎(chǔ)“主-客體”化學：主體有選擇地識別客體并與之通過弱相互作用力形成穩(wěn)定復合物的化學領(lǐng)域。超分子化學：研究兩種或兩種以上的化學物通過分子間力（靜電作用、氫鍵、范德華力等非共價鍵）相互作用締結(jié)而成的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的超分子體系的科學。7.2.2模擬酶的理論基礎(chǔ)第五頁，共46頁。美國加州大學洛杉磯分校的克拉姆(DonaldJamesCram)教授和法國路易·巴斯德大學的萊恩(Jean—MarieLehn)教授由于分別創(chuàng)立了“主—客體化學”(Host—GuestChemistry)和“超分子化學”(SupramolecularChemistry)而榮獲1987年諾貝爾化學獎。第六頁，共46頁。克拉姆的“主—客體化學”的基本思想是：具有顯著“識別能力”的某些冠醚可以作為“主體”，有選擇性地與作為“客體”的底物發(fā)生配合。第七頁，共46頁。萊恩的“超分子化學”的主要內(nèi)容是：首先要求合成具有特定結(jié)構(gòu)的分子作為接受體。接受體應具有選擇分子結(jié)構(gòu)形式的能力，又使底物可借各種分子內(nèi)作用（電性作用、氫鍵、范德華力）與受體結(jié)合，這樣，導致“分子的聚集”，這種聚集后的分子，萊恩稱其為“超分子”?！俺肿印奔嬗蟹肿幼R別，分子催化和選擇性遷移等功能?！爸鳌腕w化學”和“超分子化學”的共同意圖就是說明酶和底物之間的作用就象一把鑰匙開一把鎖一樣。第八頁，共46頁。催化劑是一種選擇性極強的反應中的第三者。催化劑與反應物及產(chǎn)物之間有一種嚴格的微妙的關(guān)系。首先，催化劑與反應物之間必須建立起“主—客體”關(guān)系?！爸鳌腕w”關(guān)系的建立需要苛刻的條件，不僅要從電子結(jié)構(gòu)上去考慮，而且還要從空間結(jié)構(gòu)上去考慮。“主—客體”關(guān)系一旦得到建立，就說明催化劑這把“鑰匙”已經(jīng)識別了反應物這把“鎖”了。但如何去開這把“鎖”，并把“鑰匙”原封不動地抽出來，還需要“超分子”。第九頁，共46頁。主-客體模擬酶膠束酶肽酶分子印跡酶7.2.3模擬酶的分類第十頁，共46頁。（1）主-客體模擬酶環(huán)糊精模擬酶合成的主-客體酶第十一頁，共46頁。天然存在的、類似酶的理想宿主分子，本身具有酶模型的特性。略呈錐形的圓筒結(jié)構(gòu)：外側(cè)親水，內(nèi)側(cè)的空腔具有疏水性。其特殊結(jié)構(gòu)使環(huán)糊精分子能夠作為主體識別并捕捉匹配的客體分子，如有機分子，形成溶于水的包結(jié)物，模擬酶識別過程。第十二頁，共46頁。人工合成的宿主分子，具有酶模型的特性。如冠醚、穴醚、杯芳烴等大環(huán)類物質(zhì)。具有底物識別能力和催化基團。第十三頁，共46頁。冠醚是一類含雜原子的大環(huán)聚醚類化合物；冠醚具有選擇性結(jié)合配體的能力，一些金屬離子或極性離子會陷入醚環(huán)中，與帶孤對電子的氧原子發(fā)生靜電相互作用；并且隨環(huán)的大小不同而與不同的離子絡(luò)合。冠醚第十四頁，共46頁。設(shè)計合成的以冠醚環(huán)和巰基為主體分子的冠醚模擬酶：第十五頁，共46頁。1942年金克(Zinke，奧地利)首次合成得到，因其結(jié)構(gòu)像一個酒杯而被稱為杯芳烴。絕大多數(shù)的杯芳烴熔點較高，在250℃以上。其上端由取代基組成，下端酚羥基。（其上部親油，下部親水，可分別與疏水性分子、極性離子結(jié)合）杯芳烴具有大小可調(diào)節(jié)的“空腔”，能夠形成主-客復合物，與環(huán)糊精、冠醚相比，是一類更具廣泛適應性的模擬酶，是繼冠醚和環(huán)糊精之后的第三代主體化合物。杯芳烴第十六頁，共46頁。①是一類合成的低聚物，其疏水空穴結(jié)構(gòu)大小可通過改變聚合度進行調(diào)節(jié)；②杯芳烴的熱穩(wěn)定性及化學穩(wěn)定性好，溶解性雖差，但通過引入適當?shù)娜〈?，具有很好的溶解性?/p>

③杯芳烴能與極性離子和極性分子形成主一客體包結(jié)物，這是集冠醚和環(huán)糊精兩者之長；④杯芳烴的合成較簡單，可望獲得較廉價的產(chǎn)品，現(xiàn)在已有多種杯芳烴商品化。

作為第三代主體超分子化合物，杯芳烴具有獨特的空穴結(jié)構(gòu)，與環(huán)糊精和冠醚相比具有如下特點：第十七頁，共46頁。表面活性劑分子在水溶液中超過一定濃度可聚集成膠束。膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境，可對底物進行包裹，類似于酶結(jié)合部位。若再將一些催化基團如：咪唑、硫醇、羥基和一些輔酶共價或非共價地連接在膠束上，相當于酶活性中心，就構(gòu)成具有催化活性的膠束模擬酶。（2）膠束酶第十八頁，共46頁。XX

膠束酶XXXXXXX第十九頁，共46頁。（3）肽酶模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。1977年，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活性為天然溶菌酶的50%。根據(jù)SOD活性部位結(jié)構(gòu)設(shè)計合成十六肽，加入Cu2+后，形成與天然SOD類似的活性部位構(gòu)象，活力是天然酶的6.8%。第二十頁，共46頁。一、什么是分子印跡技術(shù)？分子印跡技術(shù)是二十世紀八十年代迅速發(fā)展起來的一種化學分析技術(shù)；通常被人們描述為制造識別“分子鑰匙”的人工“鎖”技術(shù)。

7.2.4印記酶1.分子印跡技術(shù)第二十一頁，共46頁。分子印記技術(shù)是在分子識別基礎(chǔ)上開展的。分子識別本質(zhì)上是指主體分子對客體分子選擇性結(jié)合并產(chǎn)生某種特定功能的過程。如：酶與底物、抗原與抗體、配體與受體等的相互作用。第二十二頁，共46頁。以一種分子充當模板，其周圍用聚合物交聯(lián)，當模板分子除去后，此聚合物中間就留下了與該分子形狀相匹配的空穴，這種聚合物就像“鎖”一樣對模板分子具有選擇性識別作用；

分子印記（molecularimprinting）是指制備對某一化合物具有選擇性的聚合物的過程。該化合物稱為印跡分子（printmolecule，P）或模板分子（template，T）；制得的聚合物稱為分子印跡聚合物。分子印跡概念第二十三頁，共46頁。二、分子印記的原理印跡分子與帶有官能團的單體分子接觸時，會同單體官能團形成多重作用點，聚合后，這種作用就會被固定下來；當模板分子被除去后，聚合物中就形成了與模板分子在空間上互補的具有多重作用位點的結(jié)合部位。第二十四頁，共46頁。分子印跡原理圖第二十五頁，共46頁。分子印跡聚合物對印跡分子識別的本質(zhì)：分子印跡聚合物和印跡分子之間在化學基團以及三維空間結(jié)構(gòu)上的相互匹配性。聚合物空穴對印跡分子的特異性結(jié)合主要由功能基團的排列決定，空穴的形狀處于次要地位。

三、分子印跡聚合物對分子識別作用的本質(zhì)第二十六頁，共46頁。四、分子印記聚合物的制備方法印跡分子與單體發(fā)生相互作用：選定印跡分子和功能單體，使二者發(fā)生互補反應；聚合反應：使用交聯(lián)劑，對功能單體進行聚合；印跡分子去除：用抽提法從聚合物中除掉印跡分子，形成的聚合物內(nèi)保留與印跡分子的形狀、大小、功能團互補的空穴；后處理：成型加工和真空干燥。第二十七頁，共46頁。五、影響分子印跡選擇性識別的因素底物結(jié)構(gòu)和印記分子的一致性：底物必須與印記分子的結(jié)構(gòu)、大小相似，否則影響分辨率。聚合物與印記分子之間的作用力：作用力是影響分辨率的重要因素，若能產(chǎn)生多種相互作用力，且鍵的數(shù)目又多，則分辨率提高。

第二十八頁，共46頁。交聯(lián)劑的類型和用量：一般80%以上交聯(lián)度。交聯(lián)度小，難限定負責選擇部位的形狀和其中的基團取向，導致分辨率下降。丙烯酸類交聯(lián)劑。選擇低介電常數(shù)的溶劑：溶劑極性越大，產(chǎn)生的識別效果越弱。聚合條件：低溫聚合可穩(wěn)定印記分子和功能單體間的相互作用。第二十九頁，共46頁。能不能利用分子印記技術(shù)來制備人工酶呢？在人工酶的研究中，印跡被證明是產(chǎn)生酶結(jié)合部位最好的方法。第三十頁，共46頁。2、分子印跡酶選擇的印跡分子有：印跡底物、產(chǎn)物、底物類似物：印跡過渡態(tài)類似物：表面印跡過渡態(tài)類似物：通過分子印跡技術(shù)，印跡后的聚合物除了可產(chǎn)生底物的結(jié)合部位之外，重要的是在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導產(chǎn)生與底物定向排列的催化基團，從而表現(xiàn)出酶的性質(zhì)。性質(zhì)：遵循米氏方程。第三十一頁，共46頁。

在某些載體表面產(chǎn)生分子印記空腔或進行表面修飾產(chǎn)生印記結(jié)合部位的過程。

表面分子印跡分子印跡酶催化效率低的主要原因：底物分子在大塊的印跡聚合物中擴散很慢，從而降低酶活性。第三十二頁，共46頁。蛋白質(zhì)表面印跡—在聚合物硅石的涂層上的示意圖

第三十三頁，共46頁。

影響分子印記酶選擇性識別的因素底物結(jié)構(gòu)和印記分子的一致性；聚合物與印記分子之間的作用力；交聯(lián)劑的類型和用量：一般80%以上交聯(lián)度。聚合條件第三十四頁，共46頁。①固相萃取

通常樣品的制備都包括溶劑萃取，由于分子印跡技術(shù)的出現(xiàn)，可利用分子印跡聚合物選擇性富集目標分析物。印跡聚合物既可在有機溶劑中使用，又可在水溶液中使用，與其他萃取過程相比，具有獨特的優(yōu)點。應用：第三十五頁，共46頁。印跡分子在一定程度上可和抗原相一致；因而可用于抗體模擬；這種模擬抗體制備簡單、成本低，在高溫、酸堿及有機溶劑中具有較好的穩(wěn)定性，此外還可以重復使用。②天然杭體模擬第三十六頁，共46頁。分子印跡聚合物是高交聯(lián)聚合物，結(jié)構(gòu)過于剛性，缺乏酶的柔性，催化效率不高；單體與模板之間形成的次級作用力小，導致聚合物對反應底物的識別能力受到限制。

分子印記酶的局限性第三十七頁，共46頁。2.

生物印跡酶1．生物印跡：主體分子是生物分子，以天然的生物材料（蛋白質(zhì)、糖類）為骨架，在其上進行印跡而產(chǎn)生對印跡分子具有特異性識別空腔的過程。天然生物材料如蛋白質(zhì)，含有豐富的氨基酸殘基，它們與印記分子能產(chǎn)生很好的識別作用。2．有機相生物印跡酶第三十八頁，共46頁。生物印記酶的原理：酶蛋白分子在有機相中具有對配體的“記憶”功能。

印跡分子與蛋白質(zhì)在水溶液中結(jié)合之后，冷凍干燥，除去印跡分子，然后置于有機相中，因在有機相中，生物分子構(gòu)象的柔性被取消，保持了生物分子構(gòu)象的高度剛性。在有機介質(zhì)中酶的構(gòu)象即被固定。第三十九頁，共46頁。生物大分子在有機溶劑中柔性喪失，剛性增強，與底物結(jié)合的活性構(gòu)象被固定。第四十頁，共46頁。制備生物印跡酶的過程：使生物分子部分變性，擾亂其天然構(gòu)象；加入印跡分子，使印跡分子與部分變性的生物分子充分結(jié)合；用交聯(lián)劑交聯(lián)印跡的生物分子；用透析除去印跡分子。第四十一頁，共46頁。生物大分子作為被印記的宿主，印記酶的活性中心更接近于天然酶，催化效率高。宿主與印記分子之間形成的次級作用力大，增強了印記酶對底物的識別力。

生物印記酶的優(yōu)勢：第四十二頁，共46頁。1.簡單模擬向高級模擬發(fā)展；2.開發(fā)更多可多部位結(jié)合且多重識別功能的模擬酶；3.人工模擬酶可