植物細胞培養(yǎng)的基本過程和方法課件

第十章

植物細胞培養(yǎng)的基本過程和方法第一節(jié)植物細胞的獲取細胞來源：1、外植體；2、愈傷組織1、外植體的選擇：適當生長期的健康植株、細胞之間粘連程度小；葉片組織2、外植體的前處理：（1）沖刷材料;流水幾分鐘-數(shù)小時吐溫(2)表面浸潤滅菌；超凈臺70%酒精10-30S（3）深層滅菌；氯化汞次氯酸鈉（4）無菌水沖洗。3min/次3-10次一、從外植體直接分離植物細胞怎樣從愈傷組織分離得到細胞？P175獲得愈傷組織后，挑選質(zhì)量好的愈傷組織塊，用無菌的鑷子或小刀分割得到植物小細胞團，也可以將愈傷組織轉移到液體培養(yǎng)基中，加入經(jīng)過滅菌處理的玻璃珠，進行振蕩培養(yǎng)，使愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞，然后用適當孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大細胞團和殘渣，得到一定體積的小細胞團或單細胞懸浮液。

果膠酶增強分散效果第二節(jié)懸浮培養(yǎng)（cellsuspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)增殖的技術。

1、懸浮細胞的誘導---愈傷組織誘導

要求：松散性好，增殖快，再生能力強。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，松散易碎。

適于懸浮培養(yǎng)適于再生植株懸浮細胞生長動態(tài)：基本的懸浮培養(yǎng)體系均是將細胞分散在一定容積的培養(yǎng)液中進行，在一個培養(yǎng)周期不添加培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)體系基本是處于封閉狀態(tài)。當一種營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時，細胞即停止生長。在這種懸浮培養(yǎng)體系中，細胞擴增生長成S形曲線。細胞生長指標1、細胞生長計量:細胞計數(shù)細胞密實體積細胞鮮重細胞干重2、細胞活力測定懸浮細胞培養(yǎng)的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。

植物細胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團聚進入不同程度的分化狀態(tài)，因此要達到完全同步化相當困難。③抑制法：通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期—G1期的同步化細胞。④低溫法：冷處理也可提高培養(yǎng)體系中細胞同步化程度。第三節(jié)固定化培養(yǎng)細胞固定化是將細胞包埋在惰性支持物的內(nèi)部或貼附在它的表面。其前提就是通過懸浮培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的細胞。方法：吸附法、包埋法包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；吸附式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。1、平板培養(yǎng)2、看護培養(yǎng)3、微室培養(yǎng)4、條件培養(yǎng)（雙層濾紙培養(yǎng)）1、細胞平板培養(yǎng)

平板培養(yǎng)(plateculture)：將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術。

單細胞的分離：用于平板培養(yǎng)的小細胞團不能超過6個細胞，所以過濾時篩網(wǎng)的網(wǎng)孔大小要合適。

單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)低速離心，培養(yǎng)液洗滌2次后，調(diào)整密度為5×105／ml。

植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，厚度約1~2mm。

封口：用石蠟膜封培養(yǎng)皿。2、看護培養(yǎng)看護培養(yǎng)（nurseculture）：是由Muir1954年設計的。

操作方法：

在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細胞接種于濾紙上。當培養(yǎng)細胞長出微小細胞團以后，將其直接轉至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長4、雙層濾紙培養(yǎng)Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術相結合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。第五節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體的特點:①具有全能性；②無細胞壁障礙；③吸收能力強、分泌能力提高；④可進行細胞融合。原生質(zhì)體的制備

基礎材料準備預處理與酶解（或機械破壁）原生質(zhì)體收集與純