儀器分析法紫外可見(jiàn)分光光度法課件

儀器分析法—紫外可見(jiàn)分光光度法Contents：概述generalization光的吸收定律—朗伯—比爾定律紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)分光光度法分析條件的選擇41232.1概述generalization

分光光度法是基于物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法。按物質(zhì)吸收光的波長(zhǎng)不同，可分為可見(jiàn)分光光度法、紫外分光光度法及紅外分光光度法。特點(diǎn)：*靈敏度較高，適用于微量組分的測(cè)定。但相對(duì)誤差較大。*具有操作方便、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、靈敏度和選擇性較好等優(yōu)點(diǎn)，為常規(guī)的儀器分析方法。一．分子吸收光譜(molecularabsorptionspectrum)在分子中存在著電子的運(yùn)動(dòng)，以及組成分子的各原子間的振動(dòng)和分子作為整體的轉(zhuǎn)動(dòng)。分子的總能量可以認(rèn)為等于這三種運(yùn)動(dòng)能量之和。即：

E分子=E電子+E振動(dòng)+E轉(zhuǎn)動(dòng)如果用△

E電子，△

E振動(dòng)以及△E轉(zhuǎn)動(dòng)表示各能級(jí)差，則：△

E-電子＞△

E-振動(dòng)＞△E-轉(zhuǎn)動(dòng)

由分子中的電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷產(chǎn)生的光譜分別稱為電子光譜、振動(dòng)光譜和轉(zhuǎn)動(dòng)光譜。其對(duì)應(yīng)的波譜區(qū)范圍如下：

ΔEeΔEvΔEr電子光譜

振動(dòng)光譜

轉(zhuǎn)動(dòng)光譜

紫外可見(jiàn)光

近紅外、中紅外區(qū)

遠(yuǎn)紅外、微波區(qū)

由于分子選擇性的吸收了某些波長(zhǎng)的光，所以這些光的能量就會(huì)降低，將這些波長(zhǎng)的光及其所吸收的能量按一定順序排列起來(lái)，就得到了分子的吸收光譜。了解紫外—可見(jiàn)吸收光譜圖：

最大吸收峰：最大吸收波長(zhǎng)次峰：最小吸收波長(zhǎng)末端吸收C

H

H

O

o

ooo=

=

o=n有機(jī)分子能級(jí)躍遷有機(jī)分子包括:成鍵軌道

、

；反鍵軌道

*、*非鍵軌道

n

例如

CH2O分子的軌道：

*

n*

n**

*n

2、n→σ*躍遷，所需的能量比σ→σ*躍遷所需的能量少，吸收光譜的波長(zhǎng)一般在150—250nm處。一般發(fā)生在有機(jī)化合物中的H被雜原子取代后的產(chǎn)物中，如碘代乙烷的吸收峰在259nm處。

這種能使吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)而產(chǎn)生紅移現(xiàn)象的原子團(tuán)稱為助色團(tuán)。紅移與藍(lán)移——在有機(jī)化合物中，常常由于取代基的變更或溶劑的改變，使化合物的最大吸收包產(chǎn)發(fā)生移動(dòng)，向長(zhǎng)波方向移動(dòng)稱為紅移動(dòng)，向短波方向移動(dòng)稱為藍(lán)移。

3、不飽和有機(jī)化合物的電子躍遷類型為n→π*，π→π*躍遷，所需的能量較低，吸收峰一般大于200nm。

這兩類躍遷都要求有機(jī)化合物的分子中含有不飽和鍵的官能團(tuán)，這種含有不飽和鍵的基團(tuán)稱為生色團(tuán)。

在以上幾種躍遷中，只有-*和n-*兩種躍遷的能量小，相應(yīng)波長(zhǎng)出現(xiàn)在近紫外區(qū)甚至可見(jiàn)光區(qū)，且對(duì)光的吸收強(qiáng)烈，是我們研究的重點(diǎn)。5.影響紫外—可見(jiàn)吸收光譜的因素影響：譜帶位移；譜帶強(qiáng)度的變化等。譜帶位移：表現(xiàn)為物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)，包括有紅移和藍(lán)移。譜帶強(qiáng)度的變化：包括增色效應(yīng)（吸收強(qiáng)度增加）與減色效應(yīng)（吸收強(qiáng)度減?。?。影響的因素：（1）共軛效應(yīng)的影響A：π電子共軛體系增大，最大吸收波長(zhǎng)紅移，吸收強(qiáng)度也增加。這是由于共軛效應(yīng)，使得電子離域到多個(gè)原子之間，導(dǎo)致π-π*躍遷能量降低。同時(shí)躍遷的幾率也增大，則吸收強(qiáng)度也隨之增大。B空間阻礙使共軛體系破壞，最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移，吸收強(qiáng)度減小。（2）取代基的影響（3）溶劑的影響A溶劑的極性不同往往會(huì)引起某些化合物吸收光譜的紅移或藍(lán)移。B溶劑的酸度影響對(duì)于具有酸堿性的被測(cè)物質(zhì)，溶劑的pH變化，則溶質(zhì)的存在形式也發(fā)生變化，使分子中共軛效應(yīng)發(fā)生改變，則使吸收紅移或藍(lán)移。2.2光的吸收定律—Lambert-beer定律Lightabsorptionlaw---Lambert-beerlaw

光的選擇性吸收與物質(zhì)顏色的關(guān)系：1．可見(jiàn)光的顏色和互補(bǔ)色：

在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，不同波長(zhǎng)的光的顏色是不同的。平常所見(jiàn)的白光（日光、白熾燈光等）是一種復(fù)合光，它是由各種顏色的光按一定比例混合而得的。利用棱鏡等分光器可將它分解成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等不同顏色的單色光。

白光除了可由所有波長(zhǎng)的可見(jiàn)光復(fù)合得到外，還可由適當(dāng)?shù)膬煞N顏色的光按一定比例復(fù)合得到。能復(fù)合成白光的兩種顏色的光叫互補(bǔ)色光。

2、物質(zhì)的顏色與吸收光的關(guān)系：當(dāng)白光照射到物質(zhì)上時(shí)，如果物質(zhì)對(duì)白光中某種顏色的光產(chǎn)生了選擇性的吸收，則物質(zhì)就會(huì)顯示出一定的顏色。物質(zhì)所顯示的顏色是吸收光的互補(bǔ)色。/nm

顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠單色光(monochromaticlight)只具有一種波長(zhǎng)的光。混合光由兩種以上波長(zhǎng)組成的光。白光是由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種色光按一定比例混合而成的。物質(zhì)的顏色

是由于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性的吸收作用而產(chǎn)生的。一、朗伯—比爾定律Lambert-beerlaw

透光率

（透射比）Transmittance透光率定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光

I0透射光

Itc的單位為mol·L-1b的單位為cm這時(shí)k常用

表示。稱為摩爾吸光系數(shù)(molarabsorptivity)，其單位為L(zhǎng)·mol-1·cm-1

A=εbc例題：

用鄰二氮菲分光光度法測(cè)鐵。已知溶液中Fe2+的濃度為500g·L-1

，液層厚度為2cm，在508nm處測(cè)得透射比為0.645。

計(jì)算：吸光系數(shù)

a、摩爾吸收系數(shù)(MFe=55.85g·mol-1)解：A=-lgT=-lg0.645=0.190（三位有效數(shù)字）c=500g·L-1=5.00×10-4g·L-1

b=2cm②①

定量分析時(shí)，通常液層厚度是相同的，按照比爾定律，濃度與吸光度之間的關(guān)系應(yīng)該是一條通過(guò)直角坐標(biāo)原點(diǎn)的直線。但在實(shí)際工作中，往往會(huì)偏離線性而發(fā)生彎曲。若在彎曲部分進(jìn)行定量，將產(chǎn)生較大的測(cè)定誤差二

偏離朗伯一比爾定律的因素

朗伯一比爾定律只對(duì)一定波長(zhǎng)的單色光才能成立，但在實(shí)際工作中，即使質(zhì)量較好的分光光度計(jì)所得的入射光，仍然具有一定波長(zhǎng)范圍的波帶寬度。在這種情況下，吸光度與濃度并不完全成直線關(guān)系，因而導(dǎo)致了對(duì)朗伯一比爾定律的偏離。所得入射光的波長(zhǎng)范圍越窄，即“單色光”越純，則偏離越小。

（一）非單色光所引起的偏離

（二）非吸收作用引起的偏離

非吸收作用引起的對(duì)朗伯一比爾定律的偏離，主要有散射效應(yīng)和熒光效應(yīng)，一般情況下熒光效應(yīng)對(duì)分光光度法產(chǎn)生的影響較小。

散射效應(yīng)：朗伯一比爾定律只適用于十分均勻的吸收體系。當(dāng)待測(cè)液的體系不是很均勻時(shí)，入射光通過(guò)待測(cè)液后將產(chǎn)生光的散射而損失，導(dǎo)致吸收體系的透過(guò)率減小，造成實(shí)測(cè)吸光值增加

朗伯—比爾定律是建立在均勻、非散射的溶液這個(gè)基礎(chǔ)上的。如果介質(zhì)不均勻，呈膠體、乳濁、懸浮狀態(tài)，則入射光除了被吸收外，還會(huì)有反射、散射的損失，因而實(shí)際測(cè)得的吸光度增大，導(dǎo)致對(duì)朗伯—比爾定律的偏離熒光效應(yīng):

當(dāng)入射光通過(guò)待測(cè)液，若吸光物質(zhì)分子吸收輻射能后所產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)分子以發(fā)射輻射能的方式回到基態(tài)而發(fā)射熒光，結(jié)果必然使待測(cè)液的透光率相對(duì)增大，造成實(shí)測(cè)吸光值減小。

溶質(zhì)的離解、締合、互變異構(gòu)及化學(xué)變化也會(huì)引起偏離。其中有色化合物的離解是偏離朗伯—比爾定律的主要化學(xué)因素。例如，顯色劑KSCN與Fe3+形成紅色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：

Fe(SCN)3Fe3++3SCN－

（三）化學(xué)反應(yīng)引起的偏離

溶液稀釋時(shí)，上述平衡向右，離解度增大。所以當(dāng)溶液體積增大一倍時(shí)，F(xiàn)e(SCN)3的濃度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，導(dǎo)致偏離朗伯—比爾定律。2.3紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-VisSpectrophotometers

一、基本組成

generalprocess

光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示

1.光源

在整個(gè)紫外光區(qū)或可見(jiàn)光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。

可見(jiàn)光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長(zhǎng)范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射180～375nm的連續(xù)光譜。

2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。

①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；

②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束

③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見(jiàn)區(qū)一般用玻璃池。4.檢測(cè)器

利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。

5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)

檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理二、分光光度計(jì)的類型

typesofspectrometer

1.單光束

簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示

2.雙光束

自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。三、儀器的主要性能指標(biāo)

1、光度的準(zhǔn)確度：是指樣品在最大吸收波長(zhǎng)處吸光度的測(cè)量值與真實(shí)值間的偏差，該偏差越小，說(shuō)明儀器的準(zhǔn)確度越高。

國(guó)際上通常采用吸光度的準(zhǔn)確度來(lái)表示儀器的光度準(zhǔn)確度，常用酸性重鉻酸鉀法進(jìn)行檢測(cè)。

2、波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：是指儀器指示器上所指示的波長(zhǎng)與實(shí)際所輸入的波長(zhǎng)值之間的符合程度，常用波長(zhǎng)誤差來(lái)表示。

波長(zhǎng)準(zhǔn)確度常用稀土玻璃進(jìn)行檢測(cè)。

3、雜散光：是分光光度法測(cè)量中的主要誤差來(lái)源。

4、分辨率：指儀器對(duì)相鄰兩吸收帶可分辨的最小波長(zhǎng)的間隔能力。

5、光譜帶寬：是指從單色器射出的單色光最大強(qiáng)度的1/2處的譜帶寬度。

6、基線穩(wěn)定度與平直度：指儀器在不放置樣品時(shí)掃描100%T線和0%T線時(shí)讀數(shù)偏離的程度或基線彎曲的程度。2.4紫外—可見(jiàn)分光光度法分析條件的選擇一、溶劑選擇的原則：

1、不與被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)

2、所選溶劑在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)明顯吸收

3、對(duì)被測(cè)組分有較好的溶解能力

4、被測(cè)組分在所選的溶劑中有較好的峰形二、測(cè)量條件的選擇1、入射波長(zhǎng)的選擇：通常是根據(jù)被測(cè)組分的吸收光譜，選擇最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)為入射波長(zhǎng)。當(dāng)最強(qiáng)吸收峰的峰形比較尖銳時(shí)，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強(qiáng)峰進(jìn)行測(cè)定。

2、狹縫寬度的選擇：為了選擇合適的狹縫寬度，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)試樣的吸光度不再增加為準(zhǔn)。一般來(lái)說(shuō)，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。

3、吸光度測(cè)量范圍的選擇：

由朗伯-比爾定律可知：

A=lg1/T=εcl

微分后得：

dlgT=0.4343dT/T=-εldc

或

0.4343ΔT/T=-εlΔc

代入朗伯-比爾定律有：

Δc/c=0.4343ΔT/TlgT

要使測(cè)定的相對(duì)誤差Δc/c最小，求導(dǎo)取極小得出：

lgT=-0.4343=A

即當(dāng)A=0.4343時(shí)，吸光度測(cè)量誤差最小。

最適宜的測(cè)量范圍為0.2~0.8之間。

4、參比溶液的選擇：

測(cè)定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對(duì)光的反射和吸收帶來(lái)的測(cè)定誤差。

參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有：

（1）溶劑參比

試樣簡(jiǎn)單、共存其它成分對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)吸收弱，只考慮消除溶劑與吸收池等因素；

（2）試樣參比

如果試樣基體溶液在測(cè)定波長(zhǎng)有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時(shí)，可按與顯色反應(yīng)相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。（3）試劑參比

如果顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。（4）平行操作參比

用不含被測(cè)組分的試樣，在相同的條件下與被測(cè)試樣同時(shí)進(jìn)行處理，由此得到平行操作參比溶液。三、反應(yīng)條件的選擇：

對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，常利用顯色反應(yīng)將被測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL(zhǎng)范圍有吸收的物質(zhì)。常見(jiàn)的顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。

顯色劑

這種被測(cè)元素在某種試劑的作用下，轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)（colorreaction），所加入試劑稱為顯色劑(colorreagent)。

（一）、選擇顯色劑的一般原則：·選擇性好

所用的顯色劑僅與被測(cè)組分顯色而與其它共存組分不顯色，或其它組分干擾少?！れ`敏度要足夠高

有色化合物有大的摩爾吸光系數(shù)，一般應(yīng)有104~105數(shù)量級(jí)。·有色配合物的組成要恒定

顯色劑與被測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)要定量進(jìn)行，生成有色配合物的組成要恒定?！ど傻挠猩浜衔锓€(wěn)定性好即要求配合物有較大的穩(wěn)定常數(shù)，有色配合物不易受外界環(huán)境條件的影響，亦不受溶液中其它化學(xué)因素的影響。有較好的重現(xiàn)性，結(jié)果才準(zhǔn)確·色差大有色配合物與顯色劑之間的顏色差別要大，這樣試劑空白小，顯色時(shí)顏色變化才明顯。

（二）、顯色反應(yīng)條件的選擇溶液的酸度

許多顯色劑都是有機(jī)弱酸或有機(jī)弱堿，溶液的酸度會(huì)直接影響顯色劑的解離程度。（例如二甲酚橙）

對(duì)某些能形成逐級(jí)配合物的顯色反應(yīng)，產(chǎn)物的組成會(huì)隨介質(zhì)酸度的改變而改變，從而影響溶液的顏色。

另外，某些金屬離子會(huì)隨著溶液酸度的降低而發(fā)生水解，甚至產(chǎn)生沉淀，使穩(wěn)定性較低的有色配合物的解離。顯色溫度

有些反應(yīng)需要加熱。有些顯色劑或有色配合物在較高溫度下易分解褪色。此外溫度對(duì)光的吸收及顏色深淺也有影響，要求標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測(cè)溶液在測(cè)定過(guò)程中溫度一致。顯色時(shí)間

顯色反應(yīng)有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的顯色反應(yīng)需放置不同的時(shí)間，并在一定的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行比色測(cè)定。

四、干擾及消除方法常用的消除干擾的方法：

1、控制酸度：提高反應(yīng)的選擇性

2、加入掩蔽劑：使其只與干擾離子反應(yīng)生成不干擾測(cè)定的配合物。

3、改變干擾離子的價(jià)態(tài)：消除共存組分的干擾

4、改變測(cè)定波長(zhǎng)

5、分離干擾離子2.5測(cè)定方法及其應(yīng)用

一、一般定性分析及應(yīng)用

（一）、有機(jī)化合物的鑒定

先掃描未知化合物的吸收光譜，然后根據(jù)其吸收光譜的特征（吸收峰的數(shù)目、形狀、位置、相對(duì)強(qiáng)度）與相同條件下掃描得到的已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較而定性。

（二）、有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的分析

先將化合物的紫外—可見(jiàn)吸收光譜掃描出來(lái)，然后根據(jù)其吸收譜帶及最大吸收波長(zhǎng)處吸收值的大小，可推斷出該化合物的主要基團(tuán)及其所在位置。

（三）、化合物純度的檢驗(yàn)

將純化合物的吸收光譜與含雜質(zhì)化合物的吸收光譜進(jìn)行比較，根據(jù)兩者吸收光譜的差異進(jìn)行純度檢驗(yàn)。對(duì)雜質(zhì)檢驗(yàn)的靈敏度取決于化合物與雜質(zhì)間吸收系數(shù)的差異。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

其方法是先配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用選定的顯色劑進(jìn)行顯色，在一定波長(zhǎng)下分別測(cè)定它們的吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)，繪制A-c曲線，若符合朗伯—比爾定律，則得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用完全相同的方法和步驟測(cè)定被測(cè)溶液的吸光度，便可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的被測(cè)溶液濃度或含量，這就是標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

在儀器、方法和條件都固定的情況下，標(biāo)準(zhǔn)曲線可以多次使用而不必重新制作，因而標(biāo)準(zhǔn)曲線法適用于大量的經(jīng)常性的工作。二、單組分的定量測(cè)定方法及應(yīng)用BlankStandardSampleSample

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法(直接比較法)

將試樣溶液和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件進(jìn)行顯色、定容，分別測(cè)出它們的吸光度，按下式計(jì)算被測(cè)溶液的濃度。k標(biāo)=k