課件基因工程的基本操作程序課件

第二節(jié)基因工程的原理和技術問題：如何使大腸桿菌生產(chǎn)出人的胰島素？1獲得人的胰島素基因——目的基因的獲?、賹⒛康幕蜣D(zhuǎn)移入大腸桿菌（1）將人的胰島素基因拼接到大腸桿菌的質(zhì)粒中

——形成重組DNA分子②（2）將重組質(zhì)粒導入到大腸桿菌中？

——將重組DNA分子導入受體細胞③（3）人的胰島素基因?qū)氤晒α藛幔?/p>

——篩選含有目的基因的受體細胞④大腸桿菌能合成人的胰島素

——目的基因的表達⑤獲取重組導入檢測表達一、目的基因的獲取（獲得人的胰島素基因）DNA的粗提取1、從基因文庫中獲取目的基因：

(通常在未知DNA序列的情況下)基因組文庫的構(gòu)建：cDNA文庫的建立：2、體外直接合成目的基因

(通常在已知DNA序列的情況下)①利用PCR技術擴增目的基因變性退火延伸由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列②利用DNA合成儀化學合成

合成較小的基因（不超過幾十個堿基）例：核酸分子雜交的探針，PCR擴增的引物等。DNA合成儀②利用DNA合成儀化學合成運載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組運載體運載體自連目的基因自連AATTCG目的基因AATTCGGCTTAAGCTTAAGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG二、形成重組DNA分子（將人的胰島素基因拼接到大腸桿菌的質(zhì)粒中）重組DNA分子的組成：目的基因、標記基因、啟動子、終止子、復制原點參與的工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶二、形成重組DNA分子三、將重組DNA導入受體細胞

（將重組質(zhì)粒導入到大腸桿菌中）導入微生物細胞：用Ca2+處理受體細胞，將重組DNA與之混合；導入植物細胞：土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法等導入動物細胞：對受精卵進行顯微注射、胚胎干細胞技術、精子載體法等土壤農(nóng)桿菌法花粉管通道法基因槍法目的基因?qū)雱游锛毎纾猴@微注射法動物細胞受精卵顯微注射法例：從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA。同樣方法可獲得疫苗、生長激素等。四、篩選含有目的基因的受體細胞

（人的胰島素基因?qū)氤晒α藛幔〥NA分子雜交技術：互補顯色篩選法：原核營養(yǎng)缺陷性篩選法：載體分子攜帶營養(yǎng)成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受體細胞基因突變，不能合成營養(yǎng)物質(zhì)。兩者構(gòu)成營養(yǎng)缺陷。在缺少營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上受體細胞不存活，存活的是導入成功的受體細胞?？偨Y(jié)：如何使大腸桿菌生產(chǎn)出人的胰島素？以大腸桿菌為宿主菌進行基因的克隆

將目的基因克隆到大腸桿菌細胞中的操作步驟：

1．獲得目的基因（和質(zhì)粒載體）；

2．形成重組質(zhì)粒；

3．制備感受態(tài)細胞（Ca