實驗八聚炳烯凝膠電泳課件

血清蛋白的分離

聚丙烯酰胺凝膠電泳法一、實驗目的學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)二.基本原理(一)電泳電泳:帶電顆粒在電場的作用下,向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象.(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳用丙烯酰胺(Acr)單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下聚合成的多孔介質(zhì).以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系2.凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)

3凝膠聚合催化體系（1）光催化：核黃素

（2）化學催化：AP-TEMED催化體系Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)4.聚丙烯酰胺凝膠種類(1)連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類

不連續(xù)系統(tǒng):是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。

(2)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。

1)樣品濃縮效應(yīng)A.凝膠孔徑不連續(xù)性B.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性C.電位梯度的不連續(xù)性2)分子篩效應(yīng)3)電荷效應(yīng)(3)不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用電泳裝置電泳儀：提供直流電在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅(qū)動帶電分子的遷移垂直平板電泳槽每組（3人）做一板膠，前后可安置兩副板，兩組共用一套電泳裝置。四.實驗試劑人血清；分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液PH8.9；濃縮膠緩沖液:Tris-HCl緩沖液PH6.7；分離膠貯液:Acr28.0g,Bis0.735g,無離子水溶解定容至100ml；濃縮膠貯液:Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至100ml；過硫酸銨溶液（AP）電泳緩沖液:Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3；固定染色液脫色液五.操作步驟(一).垂直平板電泳槽的安裝注意短玻璃板是向內(nèi)側(cè)的。要將玻板底邊平齊地壓緊在紅色橡膠條上，否則容易漏膠。(二).凝膠的制備1分離膠的制備(7%)配8mL(按如下順序加入）分離膠緩沖液1mL分離膠貯液2mL去離子水4mLTEMED2uL過硫酸胺（AP)1mL將上述試劑迅速混勻后，用滴管沿壁迅速加樣至2/3處，再取大約3mL的水加在上面直至凝膠凝固為止。加入此物后請迅速混勻加樣，否則易凝固無法加樣凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面.

水封的目的是為了使分離膠上緣平直，并排除氣泡凝膠凝聚后，垂直小心拔出加樣梳，用窄條濾紙吸在玻板邊緣吸去多余的液體。(三).進樣除去底板，將制膠裝置放在電泳槽內(nèi)，加入稀釋10倍的Tris－甘氨酸電極緩沖液（注意：加緩沖液先從內(nèi)槽加入，上面沒過短玻璃板，外槽液面沒過最下一個螺絲處,加樣前要使凝膠凹形樣品槽內(nèi)的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.（用針筒將凹洞中的氣泡抽出）(四).電泳將電泳儀的正極負極與電泳槽連接（方向切勿接錯），打開電泳儀開關(guān)，開始時將電壓調(diào)至150V，待樣品進入分離膠時，將電壓調(diào)至250V。當藍色染料遷移至距離凝膠下端2cm時，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。電泳結(jié)束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，（不要撬兩邊耳朵處，易斷裂）在膠板一端切除一角作為標記，用緩沖液沖洗膠板，將其移至大培養(yǎng)皿中染色?！鶆兡z時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.1、Acr和Bis為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作應(yīng)戴手套。2、玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時凝膠板易斷裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴格的清洗。

3、安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏，但亦不可太用力旋，易將玻板邊緣壓破。

4、制備濃縮