生物制藥技術(shù)2-基因構(gòu)建課件

生物制藥技術(shù)2016-3-71《生物制藥技術(shù)（含實(shí)驗(yàn)）》課程教學(xué)大綱2生物制藥研發(fā)的基本流程3基因構(gòu)建發(fā)酵培養(yǎng)分離純化制劑研究質(zhì)量研究中試放大穩(wěn)定性研究藥效學(xué)研究安全藥理研究臨床申報(bào)藥學(xué)(實(shí)驗(yàn)室)藥學(xué)(中試)藥理學(xué)臨床試驗(yàn)2.1.1基本概念2.1.2質(zhì)粒、載體2.1.3工程細(xì)胞與細(xì)胞庫2.1.4表達(dá)方式選擇2.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)2.1.6實(shí)例2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建5第二章重組蛋白藥物的藥學(xué)概論2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建基因重組——分子水平、提取、連接、轉(zhuǎn)染、復(fù)制、表達(dá)別稱——基因工程、DNA重組、遺傳工程、基因操作、克隆工程細(xì)胞的三要素基因載體宿主細(xì)胞62.1.1基本概念基因——一段具有蛋白結(jié)構(gòu)編碼的核酸序列載體——質(zhì)粒、噬菌體、病毒限制性內(nèi)切酶、連接酶抗生素抗性基因——Kan、Neo、Tet、Amp、Str宿主細(xì)胞——細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建72.1.1基本概念2.1.2質(zhì)粒、載體2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建92.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建102.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建11原始種子庫主種子庫工作種子庫2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建13調(diào)控調(diào)控生物遺傳中心法則DNARNAProtein2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建14蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)PrimaryStructure——ThesequenceofaminoacidsonthepolypeptidechainSecondaryStructure——Conformationofthepolypeptidechain(3Dstructure)TertiaryStructure——ThreeDimensionalStructure(Folding)oftheproteinQuaternaryStructure——Complexationwithotherproteins(Similarordissimilarstructures)2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建152.1.4表達(dá)方式選擇2.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建172.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建182.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)SolubleInclusionBodySecreting2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)192.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)正常細(xì)胞生長特性錨地依賴性血清依賴性接觸抑制性形態(tài)依賴性體外培養(yǎng)正常細(xì)胞改變某些特征，越過生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)無限制分裂——細(xì)胞系形成2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)212.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)受體細(xì)胞條件細(xì)胞系特征——喪失細(xì)胞接觸抑制和錨地依賴性遺傳穩(wěn)定性——外源基因多次傳代不丟失合適的標(biāo)記——便于篩選與維持生長快且齊——分裂周期短，生長均一安全性——不合成、分泌致病物質(zhì)，不致癌以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動物受體細(xì)胞必須條件2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建222.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)遺傳標(biāo)記哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建232.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)真核表達(dá)載體必要原件高活性啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、有效mRNA翻譯信號復(fù)制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)志基因內(nèi)含子內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建

一般真核mRNA的翻譯都需要5'帽子來介導(dǎo)核糖體結(jié)合，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5'端具有一段較短的RNA序列（約150-250bp），這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合，起始蛋白質(zhì)翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internalribosomeentrysite,IRES）252.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)的方式IPTG/乳糖低溫pH低磷表達(dá)檢測方式表達(dá)標(biāo)志物電泳GFP遺傳穩(wěn)定性基因穩(wěn)定性——瓊脂糖電泳、指紋圖譜、PCR、測序表達(dá)穩(wěn)定性——表達(dá)標(biāo)志物、活性四環(huán)素蛻皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建262.1.5基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)組織纖溶酶原激活劑2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建292.1.6實(shí)例組織纖溶酶原激活劑2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建302.1.6實(shí)例tPArPA

527個氨基酸分子量65kD缺失突變

355個氨基酸

分子量39kDKringleⅡ、絲氨酸蛋白酶區(qū)Finger區(qū)、KringleⅠ、KringleⅡ、EGF區(qū)、絲氨酸蛋白酶區(qū)2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑312.1.6實(shí)例2.1基因與工程細(xì)胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑322.1.6實(shí)例載體：pET-44a宿主菌：BL21酶切位點(diǎn)：PshAⅠ/HindⅢ2.1

基因與工程細(xì)胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑3