FCM樣本制作課件

流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備汪洪濤C座402bb_4/18/20231免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀BD公司FACSCalibur4/18/20232免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心凡是能被熒光素標(biāo)記的且這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)的細(xì)胞或顆粒，都可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器。

FCM的應(yīng)用廣泛：4/18/20233免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式參與研究的學(xué)科種類(lèi)4/18/20235免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心應(yīng)用流式發(fā)表的論文統(tǒng)計(jì)4/18/20236免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心怎樣利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行科學(xué)研究呢？？？？4/18/20237免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管4/18/20239免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心2mainsortsofparametersaremeasuredLightScatterFluorescence流式的工作原理4/18/202310免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心LightScatter流式細(xì)胞儀的散射光信號(hào)4/18/202311免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的散射光信號(hào)FSC:表示細(xì)胞大小SSC:表示細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度4/18/202313免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心光源FSC測(cè)大小SSC測(cè)粒度SSC↑c(diǎn)ell粒度↑FSC↑c(diǎn)ell體積↑散射光信號(hào)流式細(xì)胞儀信號(hào)獲取與分析4/18/202314免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖

（紅細(xì)胞溶解后）4/18/202315免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Fluorescence1.自身熒光即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光A.細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子(例核黃素、細(xì)胞色素等)的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；B.培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；4/18/202317免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心2.特異性熒光由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光4/18/202318免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)4/18/202319免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心3.抗原豐富度決定熒光素的選擇高密度表達(dá)的抗原我們可以應(yīng)用任何熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)，低密度表達(dá)的抗原就需要我們應(yīng)用高信噪比高的熒光素例如：細(xì)胞表面的CD3細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體而IL-4則最好用APC等高信噪比的熒光素標(biāo)記的抗體4/18/202321免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心DirectStainingCD4+cellplusmonoclonalantibodytoCD4conjugatedwithFITC4/18/202322免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心IndirectStainingCD4+cellplusunconjugatedantibodytoCD4plusFITCconjugatedgoat-anti-mouseIgGassecondaryantibody.4/18/202323免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀測(cè)定的是單個(gè)粒子的熒光

要求樣本必須是單細(xì)胞的懸液如何制作樣本？單層培養(yǎng)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞實(shí)體組織分散成單個(gè)細(xì)胞染色等操作4/18/202325免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉封閉：血清和同型抗體4/18/202326免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞基本皺縮變圓，此時(shí)細(xì)胞吹打可下細(xì)胞完全皺縮變圓，此時(shí)應(yīng)棄去胰酶，加入培養(yǎng)基后輕搖可將細(xì)胞從細(xì)胞瓶壁上洗下4/18/202329免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心4.加入染色緩沖液（PBS+1%BSA），反復(fù)吹打，使之成為單細(xì)胞懸液5.移入離心管內(nèi)，離心1000-1500rpm5min6.棄上清，重懸管內(nèi)細(xì)胞后，加染色緩沖液，洗滌細(xì)胞4/18/202330免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心二、實(shí)體組織分散成單個(gè)細(xì)胞機(jī)械法剪刀剪碎、手術(shù)刀切碎、勻漿器勻漿、尼龍網(wǎng)或者不銹鋼網(wǎng)酶處理法胰酶、膠原酶溶菌酶木瓜蛋白酶等等單純采用機(jī)械或者酶處理法效果都不太理想，往往是將兩者結(jié)合4/18/202331免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)體瘤分散試驗(yàn)實(shí)例：1.從動(dòng)物身上取瘤后，立即投入4度含有10％NCS的培養(yǎng)介質(zhì)中2.取0.2～0.5g瘤組織并切碎3.切碎瘤組織放入混合酶液中（DNA酶＋膠原酶＋鏈霉蛋白酶）4.37度消化30－60min5.過(guò)濾，離心，棄上清6.用含10％NCS的培養(yǎng)介質(zhì)洗滌細(xì)胞2次7.重懸細(xì)胞300目或者400目（37um）濾網(wǎng)過(guò)濾目x孔徑＝154004/18/202332免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心單細(xì)胞懸液的處理根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，處理過(guò)程亦不相同細(xì)胞表面標(biāo)記分子檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析細(xì)胞周期分析細(xì)胞早期凋亡分析4/18/202333免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞表面標(biāo)記分子檢測(cè)－淋巴細(xì)胞亞群分析抗凝外周靜脈血10～30ul染色溶血?jiǎng)┤苎旧彌_液洗滌1％PFA固定15分鐘上流式檢測(cè)管號(hào)檢測(cè)項(xiàng)目

熒光抗體1空白對(duì)照不加任何抗體2調(diào)補(bǔ)償管Anti-CD3-FITC3調(diào)補(bǔ)償管Anti-CD4-PE4同型對(duì)照IgG1-FITC/IgG2-PE5CD4+TAnti-CD3FITC+CD4PE6CD8+TantiCD3FITC+CD8PE7BcellantiCD3FITC+CD19PE8NKcellantiCD3FITC+CD16/56PE4/18/202334免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心淋巴細(xì)胞亞群報(bào)告模式CD4+CD8+4/18/202335免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心胞內(nèi)細(xì)胞因子分析－PBMC產(chǎn)生IFN-測(cè)定取抗凝外周靜脈血1mlPMA+Ionomysin37℃4hMonosin37℃2h收集細(xì)胞，洗滌，(表染)溶血、洗滌、固定破膜、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色洗滌，加1%PFA，檢測(cè)管號(hào)熒光抗體1空白對(duì)照—2同型對(duì)照IgG1-FITC3激活對(duì)照CD69-FITC4未激活對(duì)照Anti-IFN--FITC5檢測(cè)組Anti-IFN--FITC4/18/202336免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心4/18/202337免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心IntracellularCytokine-Protocol4/18/202338免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞周期分析-PI染色測(cè)細(xì)胞周期上機(jī),檢測(cè)、分析獲取單細(xì)胞懸液，洗滌70%冷乙醇4℃2hRNaseA懸浮消化30minPI染液作用4℃30min篩網(wǎng)過(guò)濾管號(hào)熒光素1空白對(duì)照組—2檢測(cè)組

PI上機(jī)檢測(cè)4/18/202339免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心4/18/202340免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞周期G1MG2SQuiescentcellsG04/18/202341免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心AtypicalDNAHistogramG0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents4/18/202342免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心4/18/202343免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞早期凋亡分析-AnnexinV/PI雙染色法細(xì)胞收集，PBS洗滌1次AnnexinV-FITC/PI染色4℃30min