氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選和鑒定課件

氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷性的篩選與鑒定————芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)流程圖1一：認(rèn)識(shí)芽孢桿菌芽孢桿菌（Bacillaceae），細(xì)菌的一科，能形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌或球菌。包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等。它們對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道等處。芽孢桿菌bacillus桿菌科的一屬細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)原理有益芽孢桿菌

蘇云金芽孢桿菌可用于植物保護(hù)，殺滅害蟲；枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌可用于畜牧水產(chǎn)飼料添加劑、用于水環(huán)境凈化；多粘類芽孢桿菌具有固定分子態(tài)氮的能力。芽孢桿菌生物工程

芽孢桿菌各屬擁有各自生物學(xué)特性，通過基因選育等生物工程學(xué)，可以將自然界的菌種人工選育出特定功能強(qiáng)勢(shì)的菌種，應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)各個(gè)方面。在抗生素污染問題越來越嚴(yán)重的今天，有益的芽孢桿菌的應(yīng)用研究，可能是解決抗生素問題的一個(gè)有效方案。適合芽孢桿菌的培養(yǎng)基1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20gq瓊脂，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。ph為7即可。LB培養(yǎng)基成分:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeastextract)5g/L氯化鈉(NaCl)10g/L

瓊脂15~20g水1000ml誘變方法物理誘變應(yīng)用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發(fā)變異化學(xué)誘變化學(xué)誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學(xué)效應(yīng)，如引起染色體斷裂等，常用于處理遲發(fā)突變，并對(duì)某特定的基因或核酸有選擇性作用。化學(xué)誘變劑主要有：①烷化劑。這類物質(zhì)含有1個(gè)或多個(gè)活躍的烷基，能轉(zhuǎn)移到電子密度較高的分子中去，置換其他分子中的氫原子而使堿基改變。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亞胺（EI）、亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸堿基類似物。為一類與DNA堿基相類似的化合物。滲入DNA后，可使DNA復(fù)制發(fā)生配對(duì)上的錯(cuò)誤。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。③抗生素。如重氮絲氨酸、絲裂毒素C等，具有破壞DNA和核酸的能力，從而可造成染色體斷裂。淘汰野生型菌株的方法有抗生素法：細(xì)菌用青霉素法：細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖，而青霉素能抑制細(xì)胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細(xì)胞壁。處在生長(zhǎng)繁殖過程的細(xì)菌對(duì)青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處休止?fàn)顟B(tài)的細(xì)菌。將誘變處理后的菌懸液分離加有抗生素的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后野生型細(xì)胞由于正常生長(zhǎng)繁殖而被殺死，營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞因不能生長(zhǎng)而被保留下來，達(dá)到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇，引起細(xì)胞膜的損傷，殺死生長(zhǎng)繁殖過程的真菌，起到富集營(yíng)養(yǎng)缺陷型的作用。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出點(diǎn)植對(duì)照法法

誘變后的孢子或菌體，經(jīng)富集培養(yǎng)，涂布分離在完全培養(yǎng)基平板進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落孢子成熟后，用滅菌的牙簽或接種針把每個(gè)菌落上孢子或菌體分別接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上的相應(yīng)位置，同時(shí)培養(yǎng)，然后觀察對(duì)比菌落生長(zhǎng)情況。如果基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)而完全培養(yǎng)基相應(yīng)位置上生長(zhǎng)的菌落，可能為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基斜面上，進(jìn)一步復(fù)證。該法可靠性強(qiáng)，但工作量大。影印法經(jīng)富集后的孢子或菌體分離在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌落成熟（母皿），用滅菌后的特制“絲絨印?！痹谀该笃桨寰渖陷p輕一印，再轉(zhuǎn)印到方位相同的另一基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板上。培養(yǎng)后觀察比較菌落生長(zhǎng)情況，凡是在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，而在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，分別移接到以上兩種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)一步復(fù)證。另外還可采用更簡(jiǎn)便的方法，以上印模從母皿中沾上菌體細(xì)胞后，僅影印在基本培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，生長(zhǎng)的菌落情況與存放于冰箱的母皿菌落比較即可檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型。本法適用于細(xì)菌、酵母菌，其次對(duì)小型菌落的放線菌和霉菌也適用。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡(jiǎn)介本實(shí)驗(yàn)以芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，通過誘變處理，本組采用紫外誘變處理，產(chǎn)生氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株，再通過抗生素法淘汰野生型菌種，用影印法檢出缺陷性的菌株，并對(duì)缺陷性菌株進(jìn)行鑒定具體步驟及時(shí)間安排第一周實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與準(zhǔn)備，與小組成員進(jìn)行討論認(rèn)真分析實(shí)驗(yàn)題目，確立實(shí)驗(yàn)方法，與步驟第二周，按如下比例配置，但是用量整體降為原來的十分之一，即蒸餾水由1L降到100ml:1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+瓊脂20克，或牛肉膏蛋白胨配方法(1000ml)加10g的葡萄糖,調(diào)ph為7。滅菌后，將菌種接到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。1第三周，本組實(shí)驗(yàn)為了不引入其他化學(xué)物質(zhì)所以采用紫外誘變處理，首先將實(shí)驗(yàn)材料—芽孢桿菌配置成菌懸液。按如下比例配置，但是用量整體降為原來的十分之一，即蒸餾水由1L降到100ml:1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。ph為7即可。進(jìn)行滅菌后，將培養(yǎng)的芽孢桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，制成菌懸液。將菌懸液置于紫外燈下進(jìn)行照射990S，然后進(jìn)行遮光培養(yǎng)48小時(shí)。進(jìn)行中間培養(yǎng)3代以上。3第五周，突變菌株的檢出。經(jīng)富集后的菌體分離在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌落成熟（母皿），用滅菌后的特制“絲絨印?！痹谀该笃桨寰渖陷p輕一印，再轉(zhuǎn)印到方位相同的另一基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板上。培養(yǎng)后觀察比較菌落生長(zhǎng)情況，凡是在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，而在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，分別移接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)一步培養(yǎng)觀察。4第六周，氨基酸缺陷型的鑒定。在同一平皿上測(cè)定一種缺陷型菌株對(duì)許多種生長(zhǎng)因子的需求情況為生長(zhǎng)譜法單一生長(zhǎng)因子：鑒定氨基酸或維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，較為簡(jiǎn)便的方法是分組測(cè)定法。將21種氨基酸，組合6組，每6種不同氨基酸歸為一組。組別氨基酸組合組1賴氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸異亮氨酸2纈氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸3蘇氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸絲氨酸5鳥氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸異亮氨酸組氨酸天冬氨酸絲氨酸谷氨酰胺5將檢出的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌落接種于5mlLB液試管中，37℃培養(yǎng)14－16。培養(yǎng)16h的菌液離心。3500rpm，10min，棄上清，加生理鹽水，打勻沉淀，再次離心。加5ml生理鹽水制成菌懸液。取其1ml于培養(yǎng)皿中，加入融化