實(shí)驗(yàn)三質(zhì)粒的提取課件

實(shí)驗(yàn)三質(zhì)粒提取與電泳【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】

堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤(pán)繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH值4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此，復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此己完全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA分子與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。(二)材料1.葡萄糖2.三羥甲基氨基甲烷（Tris）3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氫氧化鈉5.十二烷基硫酸鈉(SDS)6.乙酸鉀7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10．胰RNA酶11．氨芐青霉素12．蔗糖13．溴酚藍(lán)14．酚15.含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌16．吸頭、小指管(三)試劑1.溶液I50mmol/L葡萄糖

25mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl(pH8.0)10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等體積混合3.溶液III5mol/L乙酸鉀60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL4.TE緩沖液

10mmoL/LTris·HCl(pH8.0)1mmoL/LEDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶將RNA酶溶于10mmoL/LTris·HCl(pH7.5)、15mmoL/LNaCl中,配成10mg/mL的濃度,于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫,保存于-20℃。7.凝膠加樣緩沖液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚蘭。5.加200μL溶液Ⅱ（新鮮配制），蓋緊管蓋，混勻內(nèi)溶物，將離心管放冰上5min。6.加入150μL溶液Ⅲ（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置15min。7.12000r/min離心15min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。8.向上清中加入等體積酚:氯仿（1:1）或氯仿:異戊醇(24:1)（去蛋白），反復(fù)混勻，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9.向上清中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后，室溫放置5～10min。12000r/min離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。10.用1mL70％乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。11.加50μLTE緩沖液，(其中含有20μg/mL的胰RNA酶)，使DNA完全溶解，-20℃保存。12.紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品濃度(1μLDNA+49μL