質(zhì)粒提取、定量與酶切鑒定課件

質(zhì)粒DNA的提取、定量

與酶切鑒定ExtractionandIdentificationofPlasmidDNA實(shí)驗(yàn)流程圖一、堿裂解法提取質(zhì)粒三、質(zhì)粒酶切二、質(zhì)粒定量四、酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)最后做

掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法掌握紫外吸收測(cè)定DNA的方法了解質(zhì)粒酶切鑒定原理掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)材料大腸桿菌DH5a菌株pMD18-T載體易瑞質(zhì)粒小量提取試劑盒TakaraEcoRI

限制性內(nèi)切酶TakaraHindIII限制性內(nèi)切酶Takara10×M酶切緩沖液BioWest電泳瓊脂糖干粉0.5×TBE核酸電泳緩沖液EB核酸熒光染料Takara6×電泳上樣緩沖液實(shí)驗(yàn)儀器微量移液器離心機(jī)恒溫水浴箱紫外檢測(cè)儀電泳儀水平電泳槽獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外，能獨(dú)立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子基因工程常采用的載體一、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法；質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等質(zhì)粒提取方法：堿裂解法基本原理

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。染色體DNA：氫鍵斷裂，變性。質(zhì)粒DNA：大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。（不完全變性）質(zhì)粒DNA：復(fù)性，溶于溶液中染色體DNA：不能復(fù)性；形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。pH=12.6（堿性）NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)離心pMD18-T溶液S1（細(xì)菌懸浮液）裂解液S2中和液S3洗滌液W洗脫液RNaseA(100mg/ml)DNA吸附柱試劑盒的組成：溶液S1：

50mmol/L葡萄糖

10mmol/L

EDTA 25mmol/LTris-HCl(pH8.0) 2毫克/毫升溶菌酶裂解液S2：200mmol/LNaOH 1%SDS中和液S3：3mol/LNaAc(pH4.8)溶液1,取1.5ml培養(yǎng)物加入Eppendorf管中，室溫離心12000rpm×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。2,加入250μl溶液S1中，旋渦振蕩，使細(xì)菌沉淀分散，徹底懸浮。3,加入250μl裂解液S2，顛倒4～6次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，室溫靜置3min（不超過(guò)5min）。4,加入350μl中和液S3，立即溫和顛倒6~8次混勻，至出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5，室溫12000rpm離心10min。6,分次小心取上清液轉(zhuǎn)至吸附柱中（帶收集管），每次600μl，室溫12000rpm離心30s，棄濾液，將吸附柱重新放回收集管中。7,向吸附柱中加入600μl洗滌液W，12000rpm離心30s，棄濾液。8,重復(fù)步驟7一次。9,空柱10000rpm離心2min。10,取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加50μl56℃預(yù)熱的洗脫液，室溫放置1min，12000rpm離心1min，收集洗脫液（即純化的質(zhì)粒DNA），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)流程1.5mL菌液12000rpm1min菌體沉淀溶液S1250μl劇烈震蕩裂解液S2250μl顛倒混勻4-6次中和液S3350μl溫和地顛倒混勻6-8次12，000rpm10min室溫靜置3~5min至出現(xiàn)白色絮狀沉淀取600μl上清至吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗滌液W600μl12，000rpm30s12，000rpm2min取吸附柱至另一新EP管洗脫液50μl12，000rpm1min室溫靜置1min棄濾液空柱收集洗脫液備用洗滌液W600μl棄濾液棄濾液2.懸浮細(xì)胞1.收集細(xì)胞3.裂解細(xì)胞4.中和6.洗柱7.洗脫5.過(guò)柱分離加入洗脫液加入洗滌液W二、質(zhì)粒DNA定量測(cè)定利用核酸在260nm處有紫外吸收的特性基本原理紫外分光光度計(jì)操作步驟取5l提取的質(zhì)粒DNA，加入95l蒸餾水混合均勻3.用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260DNA或RNA的定量A260=1.0相當(dāng)于

50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）

20μg/ml寡核苷酸紫外光吸收法：DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0DNA或RNA的純度判定三、質(zhì)粒DNA的酶切分析質(zhì)粒DNA:～3kb

載體:pMD18-T2.7kb

基因:CHD51.4kb限制酶特異性地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的特殊DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并在此切割雙鏈DNA。分子克隆中常用的為II型限制酶，其識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)度為4～6個(gè)核苷酸的反向重復(fù)序列。限制性內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGEcoRⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTTpMD18-T反應(yīng)物

體積（μl)10×M酶切緩沖液2質(zhì)粒DNA10HindIII1EcoRI1H2O

6在一個(gè)潔凈的1.5ml離心管中混勻下列反應(yīng)物：

混合后37℃水浴1～2h質(zhì)粒DNA的酶切分析操作1234影響酶切反應(yīng)的因素底物DNA的純度反應(yīng)系統(tǒng)：(反應(yīng)緩沖液)反應(yīng)體積：甘油濃度<5%保溫時(shí)間與溫度四、瓊脂糖凝膠電泳電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中泳動(dòng)的現(xiàn)象影響遷移率的因素？電場(chǎng)樣品：大?。ǚ肿恿浚┬螤睿?gòu)型）電荷共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA＞線性DNA＞開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA質(zhì)粒DNA三種構(gòu)型：共價(jià)閉環(huán)超螺旋線性開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀瓊脂糖凝膠

瓊脂糖（Agarose）是一種多聚糖，由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。膠濃度（％）線性DNA分子大?。╧b）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3本次電泳使用1.0%瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍瓊脂糖凝膠的制備上樣：加樣前，樣品先與6×上樣緩沖液混勻電泳：電壓100v；30min結(jié)果觀察：凝膠成像儀

瓊脂糖凝膠電泳操作瓊脂糖凝膠電泳1.凝膠準(zhǔn)備①稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加0.5×TBE100ml；②微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；2.膠床準(zhǔn)備①將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙；②將膠床放在調(diào)整好的水平臺(tái)上；鋪膠：將冷卻至60℃的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約5mm；室溫下靜置凝膠固化。將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極；向電泳槽中加入0.5×TBE電泳緩沖液，越過(guò)凝膠表面即可；輕輕拔出固定在凝膠中的梳子；樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻；上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為6μl

；蓋上電泳槽，接通電源，開(kāi)始電泳；電泳條件：電壓80v；時(shí)間25～30分鐘；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。電泳結(jié)果分析：紫外檢測(cè)儀直接觀察電泳條帶13.取出凝膠，置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果，并拍照記錄。瓊脂糖凝膠電泳上樣1：DNAMarker（5

l

）2：提取的質(zhì)粒DNA（5

l

）3：質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物

（10

l

）+-1234每組上2個(gè)樣品DNAMarker(ladder)

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上樣緩沖液EDTA甘油……………增大溶液密度溴酚藍(lán)…………指示劑二甲苯胺藍(lán)……指示劑組成0.5TBE,0.5-1.4%濃度的膠中，遷移率溴酚藍(lán)=300bp

二甲苯胺藍(lán)=4kbp

染色溴化乙錠(EthidiumBromide，EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽，能插入DNA分子堿基對(duì)之間并與之結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)便，快速；靈敏度