一株自養(yǎng)硝化細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

一株自養(yǎng)硝化細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化摘要：針對前期篩選的自養(yǎng)硝化桿菌(Nitrobacter)菌株y3-2，以實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(qPCR)測定的菌液終濃度為指標(biāo)，設(shè)計單因素試驗和正交試驗對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化的硝化桿菌y3-2的培養(yǎng)基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2濃度分別為0.5、1.0、0.5g/L。最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28°C、pH8.0、搖床轉(zhuǎn)速200r/min。優(yōu)化后硝化桿菌y3-2的發(fā)酵周期由優(yōu)化前的7d縮短至4d,菌液終濃度達(dá)到4.31x109CFU/mL。關(guān)鍵詞：硝化桿菌(Nitrobacter)；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件；優(yōu)化氮素是水體污染源的主要成分之一，水體的脫氮技術(shù)已經(jīng)成為人們關(guān)注與研究的熱點(diǎn)［1］。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)脫氮工藝相比，生物脫氮具有成本低、效率高、無二次污染等優(yōu)勢?，F(xiàn)今采用最多的生物脫氮工藝為硝化一反硝化工藝，其中的硝化工藝由硝化細(xì)菌(Nitrifyingbacteria)完成⑵。硝化細(xì)菌分為自養(yǎng)型硝化細(xì)菌和異養(yǎng)型硝化細(xì)菌2類，異養(yǎng)型硝化細(xì)菌僅占很少一部分，自養(yǎng)型硝化細(xì)菌是生物脫氮過程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影響污水處理系統(tǒng)的硝化效果和生物脫氮效率［3］。硝化過程通常由氨氧化細(xì)菌(Ammonia-oxidizingBacteria，AOB)先將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，然后由亞硝酸氧化細(xì)菌(Nitrite-oxidizingBacteria，NOB)將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽［4］。與自養(yǎng)型AOB一樣，自養(yǎng)型NOB具有生長速度慢、自然條件下數(shù)量低等特點(diǎn)，這一方面使NOB的研究較為困難，另一方面也制約了其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，研究加快NOB生長速度的培養(yǎng)方法顯得尤為重要［5,6］。本研究以一株亞硝酸氧化細(xì)菌y3-2［7］為出發(fā)菌株，對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(Real-timequantitativePCRdetectingsystem，qPCR)計數(shù)的方法對其菌液濃度進(jìn)行計數(shù)，以期獲得能快速培養(yǎng)硝化桿菌y3-2的方法。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種試驗用菌種硝化桿菌y3-2由農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室發(fā)酵工程分室分離純化保藏，經(jīng)16SrDNA鑒定為硝化桿菌屬(Nitrobacter)細(xì)菌。1.1.2優(yōu)化前培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化前初始培養(yǎng)基:MgSO4?7H2O0.12g/L、NaH2PO4?2H2O1.16g/L、K2HPO4-3H2O0.33g/L、MnSO4?H2O0.0076g/L、(NH4)6Mo7O24?4H2O50pg/L、無水NaCO30.5g/L、NaNO21.0g/L、pH7.5,121C、30min滅菌。優(yōu)化前的培養(yǎng)條件為250mL三角瓶加入50mL培養(yǎng)基，200r/min、30C恒溫培養(yǎng)。1.1.3試劑亞硝酸鹽和硝酸鹽定性檢測試劑［8］：Griess試劑、鹽酸溶液、氨基磺酸銨溶液、二苯胺一硫酸試劑，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和RealMasterMix（SYBRGreen）試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，硝化桿菌qPCR標(biāo)準(zhǔn)樣品為農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室發(fā)酵工程分室自制。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基的優(yōu)化1）單因素試驗。設(shè)計單因素試驗分別考察培養(yǎng)基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2濃度對試驗菌株生長的影響。①CaCO3濃度。Na2CO3濃度1.5g/L，NaNO2濃度0.5g/L，CaCO3濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0g/L。②Na2CO3濃度。CaCO3濃度0.5g/L，NaNO2濃度0.5g/L，Na2CO3濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0g/L。③NaNO2濃度。CaCO3濃度0.5g/L，Na2CO3濃度1.5g/L，NaNO2濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L。每個單因素試驗設(shè)置3個平行，每天定性檢測NO2-、NO3-含量，觀察NO3-生成情況，記錄NO2-完全硝化所需時間，并對細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)。2）正交試驗。設(shè)置三因素三水平正交試驗考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2濃度對細(xì)菌生長的影響，每個試驗設(shè)置2次重復(fù)。1.2.2培養(yǎng)條件的優(yōu)化采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，設(shè)置單因素試驗考察培養(yǎng)溫度、pH和轉(zhuǎn)速對菌株生長的影響。①溫度。將種齡為48h的新鮮菌液以5%的接種量接種到裝有50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中（后面搖瓶試驗接種方法一致），分別在15、20、25、28、30、35°C下恒溫培養(yǎng)，pH控制在7.0?7.5，轉(zhuǎn)速設(shè)為200r/min，記錄NO2-完全硝化所需時間及菌落數(shù)；選擇適宜的溫度范圍進(jìn)行正交試驗。②pH。培養(yǎng)基pH控制為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培養(yǎng)溫度為28C，轉(zhuǎn)速設(shè)為200r/min。記錄NO2-完全硝化所需時間及菌落數(shù)。③轉(zhuǎn)速。將活化后的菌種接種到三角瓶中，28C恒溫培養(yǎng)，pH8.0，轉(zhuǎn)速分別為50、100、150、200、250r/min，記錄NO2-完全硝化時間及最終菌落數(shù)。每個單因素試驗設(shè)置3組平行。1.2.3分析方法亞硝酸鹽定性檢測使用Griess試劑法;硝酸鹽定性檢測使用二苯胺-硫酸試劑法［8］；菌液濃度定量分析：首先提取收集菌液的基因組DNA，然后使用Real-timePCR定量計數(shù)方法進(jìn)行計數(shù)［9］，qPCR反應(yīng)體系總體積為20pL，含有RealMasterMix/20xSYBRsolution9pL、FGPS872（5'-TTTTTTGAGATTTGCTAG3）1pL（終濃度100nmol/L）、FGPS1269（5'-CTAAAACTCAAAGGAATTGA3）1pL（終濃度100nmol/L），DNA模板1pL，超純水8pL。Real-timePCR反應(yīng)程序為：95C預(yù)變性4min；95C變性20s，50C退火20s，68C延伸40s，共循環(huán)40次；最后一步設(shè)置自動制作溶解曲線。通過計算機(jī)對樣品PCR結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR結(jié)果進(jìn)行對比分析，計算出擴(kuò)增基因片段的拷貝數(shù)，從而推算出樣品中的菌體含量。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果2.1.1不同CaCO3濃度對y3-2生長及硝化作用的影響近年來多項研究表明NOB具有附著生長的特點(diǎn)，有研究者通過此特點(diǎn)對NOB進(jìn)行固定化，從而提高NOB的硝化效率［10］，本研究以CaCO3為添加物，提供y3-2生長的附著位點(diǎn)，考察其對y3-2生長的促進(jìn)作用，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，CaCO3對y3-2的生長具有明顯的促進(jìn)作用，其濃度為0.5g/L時促進(jìn)作用最佳，菌液終濃度達(dá)8.0x108CFU/mL，而未添加CaCO3的對照組菌液濃度不足1.0x108CFU/mL。此外，CaCO3添加濃度為0.5g/L時，硝化速度也明顯加快，NO2-完全硝化僅需5d，而對照組需要9d。2.1.2不同Na2CO3濃度對y3-2生長及硝化作用的影響Na2CO3濃度對y3-2生長和硝化作用的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，Na2CO3濃度為1.0?3.0g/L時NOB具有良好的生長勢，其中1.0g/L試驗組細(xì)菌生長情況最好，菌液終濃度最高，且完全硝化NO2-僅需5d；當(dāng)Na2CO3濃度小于1.0g/L時，y3-2生長速度很慢，原因是過低的碳源濃度使y3-2生長不充分，生物量較低。在氮源濃度一定的情況下，碳源濃度過高致使培養(yǎng)液中碳氮比（C/N）過高，會導(dǎo)致細(xì)菌對氮源的代謝利用發(fā)生異常，從而細(xì)菌繁殖緩慢，因此Na2CO3濃度高于3.0g/L時菌液中終濃度較低，NO2-完全轉(zhuǎn)化所需時間也延長。2.1.3不同NaNO2濃度對y3-2生長的影響NO2-是NOB生長與繁殖過程中唯一的氮源，它是控制NOB生長的重要因素，不同NO2-濃度對y3-2生長的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，NaNO2濃度為0.5?4.0g/L時對NOB生長有明顯的促進(jìn)作用，0.5g/L時y3-2生長速率最快，NaNO2為4.0g/L時菌液終濃度最大，約為2.0x109CFU/mL；但隨著NaNO2濃度進(jìn)一步升高，y3-2的生長被抑制，且完全硝化NO2-的時間也逐漸延長。這是因為NO2-濃度過低使細(xì)菌缺乏充分的底物來進(jìn)行繁殖，而濃度過高時會對y3p2.2培養(yǎng)條件優(yōu)化的結(jié)果2.2.1溫度對y3-2生長和硝化作用的影響有文獻(xiàn)報道NOB在15?30°。具有較好的生長狀態(tài)和硝化活性［11］。y3-2在不同培養(yǎng)溫度下的生長及硝化NO2-的情況見圖4。從圖4可以看出，菌液終濃度隨培養(yǎng)溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢，28°C時y3-2的菌液終濃度最高，此時完全硝化0.5g/LNaNO2所需時間為4d。2.2.2pH對y3-2生長和硝化作用的影響pH不同會導(dǎo)致菌株酶活力的變化，從而使菌體生長和代謝能力發(fā)生改變［12］，傳統(tǒng)研究認(rèn)為pH在6.5?8.0適宜NOB生長，在pH8.0?8.5范圍內(nèi)NOB硝化效率最高［13］。pH對y3-2生長和硝化作用的影響見圖5。從圖5可以看出，pH為8.0時菌液濃度可達(dá)1.68x109CFU/mL，明顯高于其他處理，說明y3-2的最適培養(yǎng)pH為8.0，此時完全硝化0.5g/LNaNO2所需時間為4d。2.2.3搖床轉(zhuǎn)速對y3-2生長和硝化作用的影響NOB是好氧性細(xì)菌，溶氧量對其生長有著重要的影響，一般而言溶氧需控制在2mg/L以上［14］。在一定溫度下溶氧是裝液比（培養(yǎng)基裝液量/三角瓶體積）和搖瓶轉(zhuǎn)速的函數(shù)，如果裝液比固定則轉(zhuǎn)速將直接影響培養(yǎng)基中的溶氧量°y3-2在不同轉(zhuǎn)速下的生長情況見圖6,從圖6可以看出，菌液終濃度隨著轉(zhuǎn)速的加快先快速升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200r/min及以上時菌液終濃度隨轉(zhuǎn)速加快而升高的趨勢變得平緩，說明轉(zhuǎn)速達(dá)到200r/min時溶液中的溶氧量已達(dá)到細(xì)菌最快生長所需的條件，再增大轉(zhuǎn)速也無益于提高細(xì)胞濃度，反而消耗過多的能源，增大培養(yǎng)成本。3小結(jié)與討論本研究針對一株硝化桿菌y3-2進(jìn)行了培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)液中的菌液終濃度達(dá)到了4.31x109CFU/mL，并且培養(yǎng)時間從初始的7d縮短至4d，減少了接近一半的培養(yǎng)周期，為亞硝酸氧化細(xì)菌的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。優(yōu)化后的培養(yǎng)基中Na2CO3濃度為1.0g/L、NaNO2濃度為0.5g/L，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為28°C恒溫培養(yǎng)、pH8.0、搖床轉(zhuǎn)速200r/min。另外，本試驗還探討了添加硝化細(xì)菌生長附著物CaCO3之后對細(xì)菌培養(yǎng)的影響，并確定CaCO3濃度為0.5g/L時最有利于y3-2的生長。參考文獻(xiàn)：劉晶晶，汪蘋，王歡.一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的脫氮性能研究[J].環(huán)境科學(xué)研究，2006，21(3)：121-125.陳梅娟.自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離、鑒定及norB基因工程菌的構(gòu)建[D].北京:北京化工大學(xué)，2010.余敦耀，邱雁臨，朱影.高效硝化細(xì)菌的分離與鑒定[J].化學(xué)與生物工程，2008，25(4)：60-63.鄭平，徐向陽，胡寶蘭.新型生物脫氮理論與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2004.156.琚姝，周長林，竇潔.高硝化活性亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的培養(yǎng)和應(yīng)用研究[J].微生物學(xué)通報，2005，32(5)：56-61.徐敏.硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)、保存及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D].山東青島：青島理工大學(xué)，2007.吳定心.自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.趙斌，何紹江.微生物學(xué)實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2002.277.李彬.富營養(yǎng)化湖泊系統(tǒng)藻類水華與硝化細(xì)菌種群作用關(guān)系的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.崔華平，林煒鐵.亞硝酸鹽氧化細(xì)菌固定化方法的優(yōu)化研究[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2(1)：1-5.張巍，趙軍，郎咸明，等硝化細(xì)菌在不同溫度下對氮素的去除效能研究[J].環(huán)境科學(xué)與管理，2010，35（6）：83-86.ALLEMANJE，KERAMIDAV，P