第三章-蛋白質(zhì)研究技術(shù)-1

2015年-10-19--第三章—蛋白質(zhì)研究技術(shù)-1第一頁(yè)，共55頁(yè)。提綱一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（略講）二、蛋白質(zhì)的研究技術(shù)三、蛋白質(zhì)的分類（不講）提綱第二頁(yè)，共55頁(yè)。步驟三、轉(zhuǎn)膜3

膜的選擇：NC，PVDF，尼龍膜

轉(zhuǎn)膜方法：半干轉(zhuǎn)、濕轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)膜確認(rèn)第三頁(yè)，共55頁(yè)。原料是基礎(chǔ)--膜選擇種類NCPVDF尼龍膜選擇標(biāo)準(zhǔn)a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；b.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適合用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜第四頁(yè)，共55頁(yè)。膜的選擇第五頁(yè)，共55頁(yè)。轉(zhuǎn)移方法半干轉(zhuǎn)用濾紙吸buffer來(lái)做轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移方法；適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白；半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的：1.2mA/cm2，時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的；56mA/膜1h濕轉(zhuǎn)將膜、膠、濾紙整個(gè)浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的方法；適合轉(zhuǎn)移大分子量（100KD以上）蛋白；濕轉(zhuǎn)電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定；300mA

1h第六頁(yè)，共55頁(yè)。封閉+陽(yáng)極-陰極多孔墊片濾紙凝膠膜濾紙

墊片

2層濾紙

膜（左上角標(biāo)記）凝膠（Marker靠左）

2層濾紙墊片白色夾板（正極）黑色夾板（負(fù)極）300mA1h56mA/膜1h轉(zhuǎn)移操作第七頁(yè)，共55頁(yè)。

轉(zhuǎn)膜后確認(rèn)麗春紅：轉(zhuǎn)膜后直接把纖維素膜浸到麗春紅染色液里在搖床上搖,就能把蛋白質(zhì)染成紅色了,肉眼可見(jiàn).麗春紅帶負(fù)電荷,可以與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合,同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合,從而形成紅色的條帶.

可逆染色：麗春紅對(duì)蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸餾水,PBS或其它適當(dāng)溶液洗去.與下游WB檢測(cè)完全兼容，無(wú)任何干擾蛋白質(zhì)預(yù)染Markers實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子量參照第八頁(yè)，共55頁(yè)。封閉去除非特異結(jié)合位點(diǎn)：BlockingBuffer：3%BSA

5%MilkRoomTemperature1h.

第九頁(yè)，共55頁(yè)。一抗的選擇

單克隆抗體多克隆抗體

二抗的選擇

HRP，AP，生物素，熒光素，羅丹明標(biāo)記注意：抗體的稀釋倍數(shù)是由底物和待檢測(cè)蛋白質(zhì)的豐度決定的，為了獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈推薦進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù).抗體孵育第十頁(yè)，共55頁(yè)?？贵w的選擇作為western來(lái)講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價(jià)格偏高，所以一般來(lái)說(shuō)多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來(lái)說(shuō)用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)象特異性。所以一般根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)確定。做免疫印跡時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問(wèn)題，一是所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。第十一頁(yè)，共55頁(yè)。HRP（辣根過(guò)氧化酶)AP（堿性磷酸酶）大小40kD140kD最佳酶活性PH：5－7PH：8－10酶活和二抗特異性好于AP抑制劑氰化物，硫化物疊氮鈉氰化物，砷酸鹽，有機(jī)磷，二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑穩(wěn)定性零度以下穩(wěn)定零度以下不穩(wěn)定底物很多部分動(dòng)力學(xué)特性快速慢價(jià)格便宜昂貴發(fā)光底物

ECL顯色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP兩種常用檢測(cè)酶系統(tǒng)的比較ECL：化學(xué)發(fā)光法第十二頁(yè)，共55頁(yè)。

檢測(cè)方法化學(xué)顯色法方便、便宜、有毒、靈敏度較低、費(fèi)抗體、反應(yīng)慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測(cè)化學(xué)發(fā)光法

靈敏、快速、節(jié)省抗體、反應(yīng)快、線性寬、無(wú)害、特異性高、可重新剝離檢測(cè)第十三頁(yè)，共55頁(yè)。八仙過(guò)海，各“顯”神通--顯色方法同位素法

靈敏度高、不安全、環(huán)境污染、不方便和半衰期短熒光底物法

Krypton?熒光底物第十四頁(yè)，共55頁(yè)。SDS電泳

常見(jiàn)問(wèn)題分析第十五頁(yè)，共55頁(yè)。高背景第十六頁(yè)，共55頁(yè)。條帶弱第十七頁(yè)，共55頁(yè)。其他第十八頁(yè)，共55頁(yè)。推薦對(duì)照設(shè)置

內(nèi)參對(duì)照beta-actin(肌動(dòng)蛋白)/beta-tubulin(微管蛋白)/GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)1.是檢測(cè)整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)過(guò)程及體系是否正常工作，如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)連內(nèi)參照都出不料陽(yáng)性結(jié)果的話（在內(nèi)參抗體有效的情況下），那么這個(gè)體系就是存在問(wèn)題的了。

2.半定量的標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)參一般選擇的管家基因編碼表達(dá)的蛋白，在很多組織和細(xì)胞中中都是穩(wěn)定表達(dá)的，因此可以作為檢測(cè)靶蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)。陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)一抗是否正常陰性對(duì)照檢測(cè)一抗特異性空白對(duì)照不加一抗，只加二抗，檢測(cè)二抗是否發(fā)生交叉反應(yīng)

第十九頁(yè)，共55頁(yè)。PerfectData

SDS

轉(zhuǎn)膜

封閉一抗顯色或化學(xué)發(fā)光

二抗

蛋白樣品制備

洗膜

WesternBlot第二十頁(yè)，共55頁(yè)。FurtherReadings生物秀WesternBlotting專題

Millipore的蛋白印跡手冊(cè)

Bio-Rad的westernBlotting操作手冊(cè)

Westernblot問(wèn)題解答專帖第二十一頁(yè)，共55頁(yè)。4.3蛋白質(zhì)的測(cè)序第二十二頁(yè)，共55頁(yè)。直接測(cè)定法

化學(xué)測(cè)定法質(zhì)譜間接測(cè)定法。先得到某一種蛋白質(zhì)基因的核苷酸序列，然后根據(jù)通用的遺傳密碼表間接推導(dǎo)出由其決定的氨基酸序列。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第二十三頁(yè)，共55頁(yè)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)直接測(cè)定法的主要步驟第二十四頁(yè)，共55頁(yè)。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(2)

多肽鏈的拆分第二十五頁(yè)，共55頁(yè)。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體?？捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基)。第二十六頁(yè)，共55頁(yè)。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(3)

斷開(kāi)二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止重新被氧化。第二十七頁(yè)，共55頁(yè)。第二十八頁(yè)，共55頁(yè)。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(4)測(cè)定每條多肽鏈的AA組成，并計(jì)算出AA成分的分子比(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。第二十九頁(yè)，共55頁(yè)。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序(8)確定肽段在多肽鏈中的次序

利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。第三十頁(yè)，共55頁(yè)。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。第三十一頁(yè)，共55頁(yè)。蛋白質(zhì)順序測(cè)定的基本戰(zhàn)略

將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序?qū)㈦亩畏蛛x并測(cè)出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y(cè)定二硫鍵拆開(kāi)純蛋白質(zhì)第三十二頁(yè)，共55頁(yè)。胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈（最適pH約2，此時(shí)二硫鍵不斷開(kāi)）（在二硫鍵保持完整的條件下，將蛋白質(zhì)特異切割成肽段。）經(jīng)電泳分離各肽段用過(guò)甲酸斷開(kāi)二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質(zhì)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)向90℃二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷移率發(fā)生變化然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置二硫鍵位置的確定第三十三頁(yè)，共55頁(yè)。二硫鍵位置的確定對(duì)角線電泳第三十四頁(yè)，共55頁(yè)。Sanger反應(yīng)1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸末端氨基酸殘基的鑒定N二硝基苯衍生物黃色第三十五頁(yè)，共55頁(yè)。二甲氨基萘磺酰-AA有強(qiáng)熒光，檢測(cè)靈敏度高丹磺酰氯（DNS）法末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N(DNS-aa)第三十六頁(yè)，共55頁(yè)。苯異硫氰酸酯法（PITC法、Edman降解法）末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸pH8.3苯異硫氰酸酯PITC第三十七頁(yè)，共55頁(yè)。PITCPTC-肽第三十八頁(yè)，共55頁(yè)。肽鏈外切酶從多肽鏈N-端逐個(gè)向里水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)出釋放的AA種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和AA殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線

④氨肽酶法（aminopeptidase,Apase）末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第三十九頁(yè)，共55頁(yè)。末端氨基酸殘基的鑒定肼，又稱聯(lián)氨，無(wú)色、油狀液體，主要用作火箭和噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)的燃料。多肽與無(wú)水肼加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成酰肼化物。酰肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。①

肼解法（聯(lián)氨法）、末端分析2C第四十頁(yè)，共55頁(yè)。末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2CC末端AA可用硼氫化鋰還原成α氨基醇②硼氫化鋰還原法第四十一頁(yè)，共55頁(yè)。末端氨基酸殘基的鑒定肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個(gè)水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間釋放出的AA種類和數(shù)量確定蛋白質(zhì)C-末端殘基順序。③羧肽酶法、末端分析2C第四十二頁(yè)，共55頁(yè)。4種羧肽酶的來(lái)源和專一性羧肽酶來(lái)源專一性CpA胰臟能釋放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰臟主要水解C端為Arg或Lys的肽鍵CpC植物或微生物相當(dāng)廣泛，幾乎能釋放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可釋放C端所有氨基酸第四十三頁(yè)，共55頁(yè)。1、酶解法:內(nèi)切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解多肽鏈的部分裂解第四十四頁(yè)，共55頁(yè)。R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快肽鏈水解位點(diǎn)R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)第四十五頁(yè)，共55頁(yè)。R1=Lys（K）和Arg（R）專一性較強(qiáng)，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶trypsin第四十六頁(yè)，共55頁(yè)。R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）第四十七頁(yè)，共55頁(yè)。R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快

R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶Pepsin第四十八頁(yè)，共55頁(yè)。2、化學(xué)裂解法①溴化氰水解法——選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。甲硫氨酸（Methionine），又稱蛋氨酸，對(duì)人而言是唯一的含硫必需氨基酸6、多肽鏈的部分裂解多肽鏈的選擇性降解第四十九頁(yè)，共55頁(yè)。